Candidato : Giulia Montini Matricola : 1323939 Relatore Interno : Prof. Roberto Contestabile

1. Facolta’ di ScienzeMatematicheFisiche e Naturali Corso di laureamagistrale in Genetica e BiologiaMolecolare nellaricerca di base e biomedica Analisi in silico e in vitro dell’interazionetral’enzimaumanoSerinaIdrossimetiltrasferasi e antifolati di usoclinico Candidato: Giulia MontiniMatricola : 1323939 RelatoreInterno: Prof. Roberto Contestabile (Dipartimento di ScienzeBiochimiche Alessandro Rossi Fanelli) RelatoreEsterno: Prof.ssa Francesca Cutruzzolà(Dipartimento di ScienzeBiochimiche Alessandro Rossi Fanelli) A/A 2013-2014

2. Ruolodell’SHMTnelle cellule cancerose L-Serina + THF  Glicina + Metilen-THF L’aumentato afflusso di serina viene metabolizzato dalle SHMT ed utilizzato per guidare la sintesi de novo di precursori del DNA.

3. La SerinaIdrossimetiltrasferasi L’unità catalititicamente attiva dell’enzima è il dimero PLP Glicina THF SHMT1 umana SHMT1 coniglio SHMT1 topo

4. SHMT: un target antitumorale inesplorato In trattamento III/II Fase C. Trial I Fase C. Trial Methotrexate Pemetrexed • Pochi studi focalizzati sulla ricerca di farmaci per la sua inibizione • Al contrario, sono molti i composti studiati e attualmente in trials o in trattamento per gli altri enzimi del ciclo del timidilato e la sintesi di purine (TS, DHFR, GARFT). Questi composti sono gli antifolati Pralatrexate Raltitrexed Nolatrexed Trimetrexate Plevitrexed Piritrexim Talotrexin Lometrexol AG2034 GW183

5. ObiettividellaTesi • Screening in silico degli antifolati sul sito attivo dell’SHMT1 • Definizione di un protocollo di predizione dell’energia libera di legame (ΔG) • Protocolloapplicatoagliantifolatioggetto di screening • Protocolloapplicabile per testareulteriorimolecole in futuro • La cristallizzazione di SHMT1 in complesso con uno o piudegliantifolatitestati al fine di determinarne la struttura Il lavoro di tesi si colloca in un progetto più ampio di ricerca di inibitori selettivi per le due isoforme di SHMT. Le analisi in vitrodegli antifolati non sono state oggetto del lavoro e sono state eseguite nel lab del Prof. Contestabile

6. I. Esperimenti in Silico

7. Workflow del lavoro CORRELAZIONE?

8. Methotrexate (MTX) Nolatrexed (NTX) Raltitrexed (RTX) Lometrexol (LTX)

9. Lometrexol (LTX)

10. Predizione del ΔG di legame ΔGbind,solv= ΔGbind,vacuum+ ΔGsolv,complex– (ΔGsolv,ligand+ ΔGsolv,receptor) • ΔGsolvè l’energia di solvatazione, calcolata rispettivamente per il complesso, il ligando e il solo enzima. Due modelli paralleli: l’equazione lineare di Poisson - Boltzman o il modello di Generalized Born. • ΔGbind,vacumè ottenuto calcolando l’energia media di interazione tra proteina e ligando e il contributo entropico al loro legame. Per la misurazionedell’energia media di interazioneè necessariocondurreesperimenti di dinamicamolecolaretraproteina e ligando

12. Correlazionetrairisultati in silico e in vitro PB Il metodo Poisson Boltzman sembra essere il piu accurato NTX RTX MTX LTX Il Lometrexol è il migliore tra gli antifolati provati GB RTX NTX LTX MTX

13. II. Esperimenti di Cristallografia

14. Screening dellecondizioni di cristallizzazione di SHMT1 • Screening al Robot: • Vantaggi: Tempo, risparmio della soluzione proteica • Svantaggi: cristalli troppo piccoli per la diffrazione 100 µm C Ottimizzazione

15. Ottimizzazione e prove di co-cristallizzazione 90% L’ottimizzazione è statacondotta in presenza di Lometrexole Glicinautilizzandoprevalentemente un approccioautomatizzato 10% 387 Gocce di Cristallizzazione

16. Alcunideicristalliottenuti 60 cristallicongelati e inviatiaisincrotoni di Berlino e Trieste

17. La raccoltadatimigliore La miglioreraccoltadatiè stataottenuta suun cristallo a forma di bacchetta Risoluzione: (4Å) Condizioni di cristallizzazione: 90 %0.2 M NaCl + 0.1 M Na/KphO, PEG 8K 10% 0.2 M LiSO4 +0.1 M MES pH 6 + 35% MPD

18. Processamentodeidati di diffrazione • Diffrazioneallarisoluzione di 4 Å • Autoindexing • Indicizzazione • Scalaggio Fase? Molecular Replacement Template: 1BJ4 CalcolodellaMappa di densita’ elettronica Cicli di raffinamento

19. Analisidellastruttura Finale • Nessunadensitàrelativa al Lometrexolneisitiattivi • DensitàrelativaallaGlicina in quattrodegliottositiattivi • Questa stechiometria di legame di del 50% dei siti suggerisce una regolazione allosterica di SHMT.

20. Conclusioni e Prospettive future • 4 antifolati compatibili con il sito attivo dell’SHMT1 trovati tramite screening in silico • Validazione del protocollo di predizione del ΔG di legame. Identificazione del Lometrexol come ilmiglioretragliinibitoriprovati. • Ottenimento di molticristallitramiteesperimenti di co-cristallizzazione. Il cristalloche ha generato la miglioreraccoltadati (4 Å), non mostrailLometrexolnelsitoattivo ma mostrapreziose riguardanti il binding della glicina. • Utilizzare questi risultati come linee guida per nuovi esperimenti di co-cristallizzazione • In silico, identificare e testare nuove classi di molecole capaci di inibire l’enzima

21. Ringraziamenti Prof.ssa Francesca Cutruzzolà Dr. Alessandro Paiardini Dr. Giorgio Giardina Prof. Roberto Contestabile

23. La SerinaIdrossimetiltrasferasi Negli eucarioti la struttura quaternaria osservata e’ un omotetramero (dimero di dimeri) L-Serina + THF  Glicina + Metilen-THF • Reazioni in cui e’ coinvoltoilMetilen-THF • BiosintesidellePirimidine • Biosintesidelle Purine • Metilazione del DNA e produzione di metionina

24. L’esperimento di dinamicamolecolare Preparazionedeicomplessi Il software utilizzato a talscopo e’ statoAMBER 12

25. L’esperimento di dinamicamolecolare Protocollo di quattrofasi • Minimizzazione: utile per rilassare il sistema e ottenere una buona conformazione di partenza per la simulazione • Riscaldamento: il sistema viene riscaldato gradualmente e portato alla temperatura alla quale verra’ condotta la simulazione (300K) • Equilibratura: fase nella quale tutta una serie di proprieta’ del sistema e delle macromolecole vengono monitorate sino al raggiungimento di una situazione di stabilita’ (termodinamica e strutturale) • Produzione: una volta raggiunta una situazione di stabilita’ e’ possibile raccogliere i dati di una simulazione (le traiettorie) ed utilizzare queste informazioni per fare considerazioni di carattere termodinamico, come i calcoli del ΔG di interazione

26. Predizione del ΔG di interazione • Per condurre i calcoli di energia libera di interazione si e’ utilizzato l’approccio MMPB/GBSA • I quattro antifolati sono stati quindi classificati sulla base di questi valori energetici. • I valori di energia sono stati riportati Kcal mol-1 • Elementi a favore della classificazione PB: • Dalla letteratura: PB è considerato il metodo migliore per classificare inibitori sulla base delle predizioni di energia libera di legame, e quindi e’ quello più consigliato per condurre studi post-docking (Hang et al. 2014). • Il ranking predetto da PB appare perfettamente proporzionale al numero di interazioni che ogni antifolato ha con il sito attivo dell’SHMT1 nelle pose predette da docking • Gli studi di inibizione condotti in vitro Il Lometrexol e’ ilmiglioreinibitoretraquellianalizzati