Flagellenstruktur & Sensitivity / Robustness in e coli

1. Flagellenstruktur & Sensitivity / Robustness in e coli von Andrea Ebert

2. Chemotaxis Chemotaxis: Bewegung entlang chemischem Gradient Positive in Richtung steigender Lockstoffkonzentration Negative in Richtung sinkender Schreckstoffkonzentration

3. Fortbewegung von E Coli Bakterielle Bewegung ähnelt einem „Random Walk“: Gerade Schwimmperioden werden unterbrochen durch kurzes Taumeln, das die Schwimmrichtung ändert.

4. Fortbewegung von E coli durch rotierende Flagellen CCW – Bewegung • Flagellen lagern sich zu Bündel zusammen • gerades Schwimmen (bis zu v = 30 µm/s) CW – Bewegung • Flagellen stehen radial ab • Taumeln, Richtungswechsel

5. Modulation der Taumelfrequenz ermöglicht Chemotaxis Keine Konzentrationsänderung (A) • hohe Taumelfrequenz • häufige Richtungswechsel Steigende Lockstoffkonzentration (B) • niedrigere Taumelfrequenz • längere Schwimmphasen Resultat: In Summe bewegt sich E coli in Richtung steigender Lockstoffkonzentration A B

6. Flagellenstruktur von E coli • Lange, dünne Proteinfäden • Mehrere Flagellen sind über die gesamte Zelloberfläche verteilt („peritrich“ begeißelt) • Sie dienen der Fortbewegung

7. Struktur des Flagellenapparats Flagellen sind in drei funktionelle Abschnitte gegliedert: • Filament • Haken • Basalkörper

8. Struktur des Flagellenapparats • Filament: • c.a 10µm lang • Besteht aus Protein Flagellin • Hohler, helikal gewendelter Proteinfaden Stabilität • Wirkt wie ein „Propellor“

9. Struktur des Flagellenapparats Struktur des Flagellenapparats • Haken: • Flexibles Gelenk • Ähnliche Struktur wie Filament, nur von anderem Protein gebildet

10. Struktur des Flagellenapparats • Basalkörper: • Verankerungskomplex für das Filament • Motor für Rotationsbewegung • ( ca. 50 Hz)

11. Aufbau des Flagellenapparats Beim Aufbau der Filamente werden die Proteinmoleküle durch den Hohlkanal der Flagellen bis zum äußersten Ende transportiert und dort angebaut a Verlängerung a Beschädigte Flagellen regenerierbar

12. Proteinnetzwerk der Chemotaxis

13. Proteinnetzwerk der Chemotaxis Signalprozess: Schreckstoff bindet an Rezeptor Che A wird aktiviert • aChe A-P PhosphoryliertChe Y • aChe Y-P Diffundiert zu Motor ahöhere Taumelfrequenz

14. Proteinnetzwerk der Chemotaxis Adaption: Zugabe eines Lockstoffs zur Zeit t=0 aTaumeln wird schlagartig unterdrückt aTaumelfrequenz steigt langsam wieder und passt sich der Taumelfrequenz der unstimmulierten Zelle an

15. Proteinnetzwerk der Chemotaxis Adaptionsprozess: Lockstoff bindet an Rezeptor aChe A-P wird deaktiviert aChe Y, Che B werden nicht aktiviert aMethylisierungsgrad steigt aAktivität von Che A wird wieder normalisiert aChe Y wird wieder aktiviert

16. Eigenschaften des Proteinnetzwerks • Empfindlichkeit: Signal der Rezeptoren um Faktor 100 verstärkt • Reize verschiedensten Ursprungs werden zu einem Signal kombiniert • Exakte Adaption ermöglicht Bewegung entlang zeitlichem Konzentrationsgradienten • Empfindlich auch für kleine Konzentrationsänderungen (<1%) in extremen Konzentrationen (nM-mM Bereich)

17. Robustness in bacterial Chemotaxis Experiment von Alon, Surette, Barkai & Leibler: Wie reagieren Response und Adaption auf systematische Konzentrationsveränderungen der Chemotaxis-Proteine?

18. Robustness in bacterial Chemotaxis Untersuchte Eigenschaften: • Steady-State Taumelfrequenz • Adaptionszeit • Adaptionsprezision P

19. Variation von [Che R] Methode: • Bei Klonen wird Che R • vollständig entfernt • Unter Kontrolle eines • Lac-Operons wird • [Che R] wiederhergestellt • und erhöht (bis 50fach) • Lac Operon wird durch IPTG • (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) • reguliert

20. Variation von [Che R] Ergebnis: • Adaptionspräzison unabhängig von [Che R] a„robuste“ Größe • Adaptionszeit sinkt mit zunehmender [Che R] • Steady-State Taumelfrequenz steigt mit [Che R] a„sensitive“ Größen

21. Variation verschiedener chemotaktischer Protein

22. Variation von [Che Z]

23. Messung der Motor Signalübertragung Experiment von Leibler, Cluzel, Surette Messung des Motor Outputs als Funktion der Che Y-P Konzentration

24. Versuchsaufbau

25. Messmethoden 2 simultane Messungen: • Dunkelfeldmikroskopie: aCW Bias • Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie: aChe Y-P Konzentration

26. Dunkelfeldmikroskopie • Licht wird am Objektiv vorbei geleitet

27. Dunkelfeldmikroskopie • Licht wird am Objektiv vorbei geleitet • Nur Licht, das durch das Präparat im Strahlengang gestreut wird, gelangt in das Objektiv aBild mit hellen Strukturen auf dunklem Untergrund

28. Bestimmung des CW-Bias mit Dunkelfeldmikroskopie • Flagellen werden mit Latex Kügelchen markiert • Beleuchtung mit rotem Licht • Beobachtungen werden mit Kamera aufgenommen • Videoaufnahmen werden durch Computerprogramm analysiert aCW-Bias

29. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) • Anregungslicht wird auf Probe fokussiert (möglichst kleines Anregungsvolumen) • Fluoreszenzaktive Teilchen, die in das Anregungsvolumen diffundieren, werden zu Fluoreszenz angeregt • Emittierte Photonen werden mit Photodiode detektiert aFluoreszenzintensität I(t)

30. Fusion von Che Y-P mit Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) Unter Kontrolle eines Lac-Operons wird Che Y-P zu Che Y-P-GFP fusioniert GFP dient als Marker, ermöglicht Untersuchung der zeitlichen und räumlichen Verteilung in vivo

31. Wie funktioniert Autokorrelation? Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit: Jede Intensitätsspitze steht für ein Teilchen, das gerade durch das Anregungsvolumen V diffundiert

32. Wie funktioniert Autokorrelation? Autokorrelation: Intensität wird gegen sich selbst aufgetragen Ziel: Informationsgewinn aus Fluktuationen in der Fluoreszenzintensität

33. Wie funktioniert Autokorrelation? Autokorrelation: Intensität I(t) wird gegen Intensität I(t+∆t) zu einem späteren Zeitpunkt aufgetragen

34. Wie funktioniert Autokorrelation?

35. Wie funktioniert Autokorrelation?

36. Autokorrelationsfunktion • Korrelationskoeffizient R(∆t) • Normierung: aAutokorrelationsfunktion G(∆t) Wobei: ∆t = mτ 0 ≤ m ≤ M

37. Autokorrelationsfunktion zur Bestimmung von [Che Y-P-GFP] Für zweidimensionale Translationsdiffusion gilt: G(∆t)=1/N*[1+(4Dt/ω²)] Wobei: D = Diffusionskonstante 2ω= Durchmesser des Detektionsvolumens N = Teilchenzahl

38. Eichung auf absolute Konzentration durch Korrelationsfunktion Wegen: G(∆t)=1/N*[1+(4Dt/ω²)] Gilt: G(0)=1/N Mit: C=N/V aKonzentration C von Che Y-P in Abhängigkeit der Photonenzählrate

39. Ultra-Sensitivität des Motors Kleine Konzentrationsänderungen [Che Y-P] führen zu großer Änderung im Motor bias aMotor als Verstärker Hillkoeffizient 10,3±1,1

40. Zusammenfassung • Extrazellulare Reize werden durch ein Proteinnetzwerk in Motor Output übersetzt • Motor ist ultrasensitiv • Exakte Adaption ist eine „robuste“ Größe und ermöglicht Bewegung entlang zeitlichem Gradient • a Kritisch für Chemotaxis