Efficient concerted integration by recombinant HIV-1 integrase without cellular or viral cofactors

1. Efficient concerted integration by recombinant HIV-1 integrase without cellular or viral cofactors Sapna Sinha, Michael H. Pursley and Duane P. Grandgenett JOURNAL OF VIROLOGY Avril 2002

2. 3’ 5’ 5’ 5’ CYTOPLASME ADN proviral Formation d’extrémités 5’ sortantes : Processing CAGT ACTG GTCA TGAC 2(pGpT) NOYAU Transfert de brin 3’ 3’ Génome de la cellule hôte 5’A C TG AC CA GT C A5’ TG AC CA GT 3’ 5’ 5’ 5’ CAOH ACTG GTCA HOAC CAOH ACTG GTCA HOAC Différents types d’intégration Intégration 1 LTR = Half-Site Integration (HSI) Intégration 2 LTR = Full-Site Integration Integration Concertée (FSI) Intégrase + Donneur ADN Receveur

3. Duplications au niveau du génome de l’hôte Au niveau de l’ADN cellulaire, l’intégration du génome viral entraîne une duplication de quelques paires de bases de chaque coté de l’ADN viral. La taille de cette duplication est spécifique de chaque virus 6 pb pour les virus ALSV 5 pb pour HIV-1 (Asante-Appiah and Skalka, 1997)

4. Etat des connaissances • 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs ADN  efficacité et fidélité très variables  inefficacité de d’intégration concertée  fidélité variable des duplications de 5 pb Efficacité = 10% donneur intégré à la cible en 20 min à 37°C • Grande variabilité des résultats  intervention de cofacteurs cellulaires ? rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires  efficacité FSI rINT HIV-1: HMG-I(Y) et NC  variation de l’activité de l’INT elle-même ? • rINT HIV-1 in vitro inefficace seule pour FSI Fidélité # 70% • Anomalies de repliement ? • Agrégation ?

5. Objectif de l’étude • rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une intégration concertée efficace ? • Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ? Stratégie • Purification et utilisation INT recombinante purifiée à faible concentrations  éviter l’agrégation • Étude de la coexpression INT / protéines chaperonnes GroEL-GroES chez des bactéries  éviter les anomalies de repliement de rINT

6. Matériels et méthodes (1) • Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb • marqué 32P • SupF sélection • site restriction BglII unique • Receveur • plasmide pGEM3 • rINT • Clonée dans pET11a  expression dans cellules BL21(DE3) • Protéines chaperonnes • plasmide pGroESL également exprimé dans BL21(DE3)

7. Matériels et méthodes (2) + IPTG • Purification de rINT BL21(DE3) : pET11a +/- pGroESL Centrifugation Tampon + sonication 3h surnageant culot + NaCl Lavages et centrifugations surnageant culot + NaCl 1M centrifugation surnageant INT 60% pureté + tampon standard (Mg++) 2’ 2 1 INT >90% pureté Hép Seph

8. Résultats (1) • Expression rINT dans BL21(DE3) • Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et GroEL • Stabilité des extraits INT /NaCl 1M Lysat cellulaire T0 Lysat cellulaire IPTG + chaperons surnageants

9. Résultats (2) • Purification rINT et transfert de brin  éviter agrégation rINT en solution : faible concentrations sur colonnes: utilisation totalité extrait NaCl 1M sur colonne 1 fractions les plus riches en INT  colonne 2 0 chaperons, 20 min, 37°C - + Fractions 38 à 49 rINT purifiée à basse concentration reste active  HSI et FSI Résultats identiques avec/sans GroES GroEL

10. Résultats (3) • Influence de la composition des tampons sur activité rINT ? Connaissances Zn++, Mg++ et détergents non ioniques perturbent l’association des sous-unités d’INT  perturbation activité • Tampon standard contient Mg++ • Suppression Mg++ ajout 10% glycérol  pureté identique  transfert de brin comparable 3-4: + chaperons, Seph x2 5-6: + chaperons, Hép-Seph 7-8: Hép-Seph Activité rINT indépendante de la présence de Zn++, Mg++ et glycérol dans les tampons

11. Résultats (4) • Fidélité des duplications 5pb lors de l’intégration concertée Utilisation préférentielle U5 pour intégration Fidélité # 70%sans chaperons selon les études   par les protéines chaperons ?  séquençage de la zone d’insertion Présence de protéines chaperons n’augmente pas la fidélité des duplications 5 pb

12. Résultats (5) • Comparaison qualitative des activités des rINT Action des protéines chaperons 3-7: 0 chaperons, gamme [rINt] 9-13: + chaperons, gamme [rINt] 9: reproductible  concentration seuil rINT nécessaire autre étude: chaperons améliorent très légèrement HSI -FSI Action de Zn++ Zn++ stimule la multimérisation des su d’INT et stimule légèrement HSI Légère  FSI

13. Résumé • HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs in vitro • Modèle: Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent  sur ses facultés de polymérisation  sur l’efficacité de l’intégration concertée Limites: Étude in vitro: intervention d’autres protéines chaperons in vivo ? Perspectives: Mutagénèse dirigée pour étudier les interactions structurales nécessaires à l’association en tétramères + Détergents non ioniques + Zn++ +