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Chapter 4

Chapter 4. DNA 操作技术. 学习内容：. DNA 操作酶 核酸酶 连接酶 聚合酶 DNA 修饰酶 限制性内切酶 分类和命名 酶切体系、反应条件、结果鉴定 定位酶切位点 连接. 1. DNA 操作酶. 核酸酶：剪切、缩短、降解核酸 Bal31 E. coli 外切酶 III S1 内切酶 DNase I RNase H 连接酶：连接核酸分子 聚合酶：复制 修饰酶：增加或去除化学基团 拓扑异构酶：引入或去除超螺旋的闭合环状 DNA. 作用：降解 磷酸二酯键 分为： 外切酶 内切酶.

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Chapter 4

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Presentation Transcript

  1. Chapter 4 DNA操作技术

  2. 学习内容： • DNA操作酶 • 核酸酶 • 连接酶 • 聚合酶 • DNA修饰酶 • 限制性内切酶 • 分类和命名 • 酶切体系、反应条件、结果鉴定 • 定位酶切位点 • 连接

  3. 1. DNA操作酶 • 核酸酶：剪切、缩短、降解核酸 • Bal31 • E. coli外切酶III • S1 内切酶 • DNase I • RNase H • 连接酶：连接核酸分子 • 聚合酶：复制 • 修饰酶：增加或去除化学基团 • 拓扑异构酶：引入或去除超螺旋的闭合环状DNA

  4. 作用：降解 磷酸二酯键 分为： 外切酶 内切酶 1.1 核酸酶

  5. Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的内切酶活性。 依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化 1.1 核酸酶

  6. E. coli外切酶III 只降解DNA分子 的一条链，产生 单链的DNA分子。 1.1 核酸酶

  7. 来自于真菌Aspergillus oryzae的S1内切酶作用于单链DNA或RNA。 pH4.0-4.3,Zn2+ 用途： 分析内元的位置 获得平端ds-DNA 酶量大时， 降解双链DNA 1.1 核酸酶

  8. 来自于牛胰腺的DNase I既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链。 1.1 核酸酶

  9. 1.1 核酸酶 • RNase H（E. coli） • 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA。

  10. 广泛存在于各种生物中，连接3‘端羟基和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复制、修复、以及广泛存在于各种生物中，连接3‘端羟基和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复制、修复、以及 体外重组 过程中起 重要作用。 1.2 连接酶

  11. 1.2 连接酶 • T4-DNA连接酶 • 连接粘性末端、平端 • 修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口。 • E. coli DNA连接酶 • 连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成） • T4-RNA连接酶

  12. 1.3 聚合酶 • 依赖DNA的DNA聚合酶 • 不依赖DNA的DNA聚合酶（末端转移酶） • 依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶） • 依赖DNA的RNA聚合酶 • 不依赖DNA的RNA聚合酶

  13. 1.3 聚合酶 • DNA聚合酶I • 5’-3’聚合酶活性 • 3’-5’外切酶活性 • 5’-3’外切酶活性 • 核酸内切酶活性 • 可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。

  14. 1.3 聚合酶

  15. Klenow酶 修复限制性内切酶造成的粘端 标记DNA探针 催化cDNA第二条链的合成 末端终止法测序 1.3 聚合酶

  16. 1.3 聚合酶 • T4 DNA聚合酶 • 与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。 • T7 DNA聚合酶 • 测序酶 • Taq DNA聚合酶

  17. 1.3 聚合酶 • 逆转录酶：将mRNA转录成cDNA • AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） • DNA聚合酶活性 • RNase H活性 • DNA内切酶活性 • 核酸结合活性 • M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）

  18. 1.4 DNA修饰酶 • 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。 • polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。 • 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。 • 甲基化酶具有完全相同的识别序列。

  19. 1.4 DNA修饰酶 • 甲基化酶: • 大肠杆菌中的甲基化酶 • dam甲基化酶 在5'GATC3'的腺嘌呤N6位上引入甲基，可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性。 • dcm甲基化酶 此酶在序列5‘CCAGC3’或5‘CCTGG3’中间的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII

  20. 1.4 DNA修饰酶 • 甲基化酶在基因工程中用途 • 许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使免受切割。 • 如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割 。

  21. 1.4 DNA修饰酶 • 末端脱氧核苷酰转移酶（TDT） • 3’端突出的双链DNA，Mg2+ • 平端或3‘凹端的低物，Co2+

  22. 1.4 DNA修饰酶 • T4--多核苷酸激酶（T4-PNP） • 将γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’端 • 放射性标记DNA的5’端 • 连接反应中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接头磷酸化

  23. 1.4 DNA修饰酶 • 碱性磷酸酶（BAP, CIP） • 作用于载体的5’端，提高重组效率 • 作用于外源DNA的5’端，防止自连

  24. 1.5 拓扑异构酶 • 在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋 • 在EDTA溶液中也有活性

  25. 2 限制性内切酶

  26. 2 限制性内切酶 • Restriction Endonuclease催化双链DNA分子的断裂，产生限制性片段。 • 不同来源的DNA具有不同的酶切位点以及不同的位点排列顺序，因此各种生物的DNA均呈现特征性的限制性酶切图谱。 • 在生物分类、基因定位、疾病诊断、刑事诊断以及基因重组领域起重要作用，并誉为“分子手术刀”。

  27. 2 限制性内切酶

  28. 2.1 限制性内切酶的发现 • 早在二十世纪五十年代发现一些细菌对噬菌体具有免疫性，称为寄主控制的限制。限制的出现因为在噬菌体复制合成新的颗粒之前，细菌就产生酶降解噬菌体DNA, 而细菌自身的DNA分子的酶识别位点已被甲基化修饰，这种酶被称为限制性内切酶。 • 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基础

  29. 2.2 限制性内切酶分类 • 限制性核酸内切酶可分为三大类： • I类 • II类* • III类

  30. I 类限制性内切酶 • 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 • 代表EcoB、EcoK

  31. (II型)限制性内切酶 • 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。 • II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。

  32. III型限制性内切酶 • 有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

  33. 2.3 限制性内切酶的命名原则 • 命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。 • Pvu I识别CGATCG，Pvu II识别CAGCTG, 都来自于Proteus vulgaris。 • HindIII是在Haemophilus influenzae d株中发现的第三种酶。

  34. 2.3 限制性内切酶的命名原则 • EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 • 许多内切酶识别6碱基序列，也有的识别4、5、8核苷酸序列Sau3A来自于Staphylococcus aureus品系3A，识别GATC。也有一些酶识别兼并序列，如HinfI来自于Haemophilus influenzae品系Rf，识别GANTC，N代表A, G, T, C。

  35. 钝端（平端） 粘性末端 2.4 限制性内切酶产物

  36. 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 • 垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。　　　　　

  37. II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ • 切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

  38. 2.4 限制性内切酶产物 • 同位酶（Isoschizomers）:识别序列相同但切点不同的酶。HpaII和MspI都识别5’∙∙∙∙∙∙GGCC∙∙∙∙∙∙3’，如其中有5甲基胞嘧啶，则只有HpaII能切割。 • 同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。

  39. 2.4 限制性内切酶产物 • 同裂酶（同切酶或异源同工酶）：识别位点与切割位点均相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。 • HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。

  40. 2.4 限制性内切酶产物

  41. 2.4 限制性内切酶产物 • 星号活力（第二活性） • PH • 离子强度 • 甘油浓度过高≥10%时 • 酶量 • 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下 。

  42. 2.5 DNA分子中识别位点的数目 • 四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约4096（46）个核苷酸有一个识别序列。 • λ DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点。如Bgl II只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个，意味着λDNA中GC含量少于50%。 • 这种方法只能粗略的估计，只有实验能确定到底有多少个识别位点。

  43. 2.6 反应程序 • 体系：DNA分子（溶液） 酶 缓冲液（一般pH值7.4, 含Mg2+, NaCl, 还原剂如dithiothreitol稳定酶阻止失活） 水 • 1U定义为在最佳缓冲系统和20ul体积中反应1小时，完全水解1μgDNA所需的酶量 • 反应条件一般为37°C，也有例外，如Taq I在65°C时活性最高。

  44. 2.6 反应程序 1）加入DNA 2）加入Buffer 3) 加入酶 4）37°C保温1hr或过夜 5) 反应终止，70°C加热、加入EDTA、或加入苯酚

  45. 2.7 酶切结果分析 • 通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。 • 琼脂糖凝胶电泳

  46. Standard electrophoresis (a)does not separate DNA fragments of different sizes,whereas gel electrophoresis (b) does

  47. 2.7 酶切结果分析 • DNA分子的检测 • EB染色，DNA分子小于25ng，很难检测到 • 放射性自显影。可检测2ngDNA。

  48. 2.7 酶切结果分析

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