LA CRIOCONSERVAZIONE

1. LA CRIOCONSERVAZIONE Prof. R. Schillaci

2. Crioconservazione: Profilo Storico Nel 1869 P. Mantegazza formula l�ipotesi di una banca del seme congelato a � 17�C; Nel 1945 A. Parkes dimostra che i nemaspermi soppravvivono meglio al congelamento se conservati in un�ampolla; Nel 1946 J. Rostand scopre il ruolo protettivo del glicerolo; Nel 1951 H. Stewart ottiene la Ia gravidanza a termine in un bovino inseminato con sperma congelato a �78�C; Due anni dopo (1953) il primo concepimento umano ad opera di C. Sherman realizzato utilizzando spermatozoi congelati col metodo del ghiaccio secco; Nel 1982 viene data notizia della Ia gravidanza con embrioni congelati; Nel 1984 E. Lauricella istituisce una delle prime banche del seme in Italia; Nel 1986 Chen e coll. ottengono la Ia gravidanza a termine dopo fertilizzazione in vitro di ovociti congelati.

3. Crioconservazione dei gameti maschili: Indicazioni Inseminazione eterologa Fecondazione in vitro eterologa Preservazione della fertilit� in pazienti oncologici sottoposti a chemio e/o radioterapia per il trattamento di linfomi, tumori testicolari, leucemie ecc.

4. CRIOCONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE Selezione dei donatori per AID o per FIV eterologa: Et� < 50 anni Accurata anamnesi personale e familiare Esame completo delle urine Esame del sangue comprendente: gruppo sanguigno e fattore Rh; emocromo ; transaminasi; esami sierologici per epatite A,B,C, HIV, sifilide Cariotipo periferico Spermiogramma (almeno 2).

5. MATERIALI E STRUMENTI Crioprotettore (tuorlo d� uovo, glicerolo, citrato di sodio, fruttosio) Azoto liquido Visotubi di vari colori Paillettes a sezione circolare da 0.25 cc in polipropilene Siringa da 10 ml con dispositivo flessibile di collegamento alla paillette Polvere sigillante in P.V.C. Contenitori di stoccaggio e di congelamento Sistema di congelamento verticale od orizzontale in base all�apertura del contenitore con supporti porta-paillettes.

7. Refrigerazione del Liquido Seminale: Terreni TEST Yolk Buffer freezing medium (Irvine Scientific) o simili

8. Preparazione delle paillettes Dopo liquefazione del campione, si esegue un esame seminale di base; A temperatura ambiente si diluisce il campione con un egual volume del terreno crioprotettore (1:1); Si riempiono le paillettes con la miscela campione-crioprotettore, lasciando uno spazio sufficiente all�aumento di volume che consegue al congelamento; L� estremit� libera delle paillettes viene chiusa con polvere polimerizzante P.V.C.; Le paillettes si immergono in acqua distillata per 15� a temperatura ambiente.

9. Procedura di crioconservazione secondo la tecnica dei Centri C.E.C.O.S. Preparazione dei visotubi secondo criteri di classificazione precisi (nome del donatore, data di preparazione, ecc.) e loro sistemazione all� interno dei canestri di stoccaggio in acciaio; Immersione dei visotubi in azoto liquido (-196�C); Nel caso di contenitore per il congelamento a bocca larga, disposizione orizzontale delle paillettes in singolo strato all� interno di un canestro in alluminio a maglie larghe dotato di vassoio in rame; Se il contenitore per il congelamento � a bocca stretta si utilizza un supporto porta-paillettes verticale in acciaio dotato di asta per immersione graduale .

10. Procedura di scongelamento Le paillettes vengono trasferite direttamente da �196�C a t. ambiente per 10�, quindi immerse in un bagno a 37�C per ulteriori 10�; Il campione viene fatto uscire per gravit� dopo il taglio delle due estremit� sigillate; La procedura di crioconservazione va verificata; Per l� I.U.I. e per la FIV, dopo l�allontanamento del crioprotettore, il campione seminale va trattato con le tecniche di capacitazione pi� appropriate.

11. Controllo di qualit� Se la diluizione con il terreno crioprotettore � stata corretta, la concentrazione spermatica nel campione dopo scongelamento deve variare entro +/- 10% rispetto alla met� della concentrazione spermatica iniziale.

12. LA CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI E DEGLI EMBRIONI

13. INDICAZIONI CLINICHE Embrioni Elevata produzione di embrioni soprannumerari Rischio di iperstimolazione Maggiore flessibilit� nei programmi di embriodonazione. Ovociti Produzione di un numero di ovociti superiore a quello inseminabile Immagazzinamento Creazione di banche di ovociti Maggior flessibilit� dei programmi di ovodonazione

14. CONGELAMENTO DI EMBRIONI: VANTAGGI Possibilit� di effettuare pi� trasferimenti embrionali, in un ciclo di trattamento; Riduzione degli embrioni/transfer con decremento del rischio di incorrere in gravidanze multiple; Transfer di embrioni in un ciclo spontaneo; Possibilit� di dilazionare i transfer in pazienti in et� a rischio genetico; Istituzione di banche di embrioni; Riduzione dei costi.

15. CONGELAMENTO DI OVOCITI: VANTAGGI Superamento dei problemi di natura etico-legale legati al congelamento embrionario; Possibilit� di sottoporre a un periodo di quarantena i gameti forniti dalle donatrici evitando il rischio di trasmissione di malattie infettive; Possibilit� di gestire pi� liberamente le scelte procreazionali, conservando nel tempo il potenziale dei gameti; Ausilio per le pazienti a rischio di menopausa precoce e per le pazienti in cui i cicli di stimolazione siano a rischio di cancellazione per l�indisponibilit� improvvisa del campione seminale.

18. Crioprotettori: Meccanismi d� Azione Abbassamento del punto di congelamento della soluzione, permettendo una > disidratazione cellulare durante il congelamento lento; Protezione membranaria a seguito d� interazione con essa e modificazione del suo stato fisico da fluido a parzialmente rigido; L� acqua attraversa la membrana pi� rapidamente del crioprotettore, cosicch� il I� effetto visibile sull�embrione � il raggrinzimento dei blastomeri che ritorneranno normali dopo raggiungimento dell� equilibrio osmotico; per evitare che un� improvvisa deformazione danneggi le strutture citoplasmatiche, si aggiunge il crioprotettore a tappe successive e a t.a. ; Dopo lo scongelamento, il crioprotettore va rimosso gradualmente per minimizzare lo shock osmotico. Alla soluzione di scongelamento si aggiunge il saccarosio (non penetrante) che agisce da pompa osmotica; I crioprotettori sono tossici. Bisogna controllare quindi il tempo di esposizione e la temperatura a cui avviene il processo.

20. Congelamento lento Si basa su principi che tendono ad evitare la formazione di ghiaccio intracellulare attraverso una progressiva disidratazione delle cellule; I crioprotettori pi� utilizzati sono l� 1-2 propandiolo e il saccarosio; Nei protocolli pi� diffusi � seguito da uno scongelamento rapido a temperatura ambiente; Prevede l�utilizzo di un congelatore programmabile.

21. Congelamento embrionale lento Sol.1: PBS (addizionato con albumina umana) x 5�; Sol.2: 1.5M di 1,2 PrOH in sol.1x 10�; Sol.3: 1.5M di 1,2 PrOH + 0.1M saccarosio in sol.1 e quindi caricamento delle paillettes (non pi� di tre embrioni / paillette)

22. Curva di discesa della temperatura Temperatura ambiente Decrescita fino a �7 �C alla velocit� di - 2 �C al minuto Temperatura stabile a �7 �C per 10� Decrescita fino a �30 �C alla velocit� di - 0.3 �C al minuto Rapida decrescita fino a �110 �C Immersione in azoto liquido

23. �SEEDING� Somministrazione addizionale di freddo che induce la formazione di ghiaccio nel medium extracellulare. Questo passaggio di fase avviene quando la temperatura della soluzione � uno o due gradi superiore al punto di congelamento (-7�C); Consiste nel toccare con una pinza raffreddata in azoto liquido la paillettes vicino all�estremit� (lontano cio� dalla zona contenente gli embrioni) fino a che non si osserva la formazione di ghiaccio nel punto di contatto tra paillette e pinza.

24. LO SCONGELAMENTO Sol.1: 1.5 M di PrOH + 0.1 M saccarosio in PBS x 5� Sol.2: 1.5 M di PrOH + 0.05 M saccarosio in PBS x 10� Sol.3:1.5 M di PrOH in PBS x 10� Sol.4: PBS x 5� Gli embrioni vengono quindi trasferiti in terreno di coltura e posti in incubatore.

25. CONGELAMENTO ULTRA-RAPIDO: VANTAGGI La procedura � rapida e semplice Non � necessario l�uso di congelatori biologici L� attrezzatura necessaria � poco costosa Prevede velocit� di raffreddamento maggiori e l�utilizzo di pi� elevate concentrazioni di crioprotettore (solitamente DMSO)

27. Valutazione degli embrioni post-congelamento Gli embrioni scongelati vengono valutati secondo due parametri fondamentali: integrit� dei blastomeri e attivit� mitotica dopo scongelamento.

28. ESISTE UNO STADIO EMBRIONARIO PIU� IDONEO PER IL CONGELAMENTO?

29. CRIOCONSERVAZIONE DEGLI EMBRIONI: OSSERVAZIONI Il tasso di sopravvivenza dopo scongelamento � simile per gli zigoti e per gli embrioni a 2-4 cellule ma nessuno di quelli a 2 cellule si � impiantato dopo trasferimento; Embrioni originati da zigoti scongelati si impiantano nonostante eventuali frammentazioni citoplasmatiche, mentre tali embrioni scongelati non si impiantano mai; Il pi� importante fattore morfologico di valore prognostico dopo scongelamento � l� adesione tra le cellule, bench� il danno pi� comunemente osservato � la rottura della zona pellucida; Il clivaggio e la capacit� d� impianto degli zigoti scongelati � simile a quello della controparte fresca.

30. CONGELAMENTO DI BLASTOCISTI : VANTAGGI Diminuzione dell� entit� del danno da congelamento dato l� elevato numero di cellule per embrione Informazioni sulla reale potenzialit� di sviluppo dell� embrione prima del congelamento Riduzione consistente del carico di lavoro.

32. VARIANTI TERAPEUTICHE NEL TRANSFER DI EMBRIONI SCONGELATI CICLO SPONTANEO TERAPIA SOSTITUTIVA: E2 + P.

34. Fattori Determinanti La selezione degli embrioni per il congelamento; Il protocollo di congelamento e scongelamento; La supplementazione ormonale nel ciclo di trasferimento; La stimolazione ovarica nel ciclo in cui sono stati prelevati gli ovociti.

35. Blastocisti in fase di congelamento

37. Crioconservazione degli ovociti

38. Le prime applicazioni cliniche del congelamento ovocitario Prime gravidanze a met� degli anni �80 (Chen 1986; Al-Hasani 1987; Van Uem 1987); Dopo l�iniziale entusiasmo, non vengono riportate gravidanze per i successivi 10 anni; I primi successi si ottengono utilizzando protocolli di congelamento lento basati sull�utilizzo del DMSO oggi diffusamente sostituito dal PrOH in associazione al saccarosio; Almeno in un caso, gli ovociti sottoposti a congelamento vengono ritenuti immaturi al momento del prelievo e pertanto coltivati per le successive 24h prima della conservazione. Tale circostanza pu� aver influito sulla sopravvivenza e la capacit� di sviluppo.

39. CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI: VARIABILI Dimensioni dell� ovocita Qualit� ovocitaria Et� dell� ovocita Stadio maturativo Cumulo ooforo (?)

40. CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI: VARIABILI Tipo di crioprotettore (propandiolo e saccarosio ma anche DMSO); Concentrazione, durata dell� esposizione e rimozione del crioprotettore; Tipo di congelamento (raffreddamento lento o vitrificazione).

41. Dimensioni dell�ovocita Le dimensioni rilevanti dell� ovocita umano maturo hanno importanti conseguenze sul successo del congelamento. Le cellule di grosse dimensioni hanno un basso rapporto superficie/volume, per cui si dimostrano meno efficienti nei confronti della permeabilit� al crioprotettore e nella disidratazione. E� pi� facile causare uno stress osmotico e pi� difficile evitare la formazione di ghiaccio intracellulare. In quest�ottica, la permeabilit� dell� ovocita all�acqua e ai soluti risulta determinante per il successo del protocollo di congelamento ed � divenuta un importante oggetto d�indagine.

42. Caratteristiche biofisiche dell�ovocita Gli ovociti murini sono stati spesso utilizzati come modello per definire protocolli di congelamento per gli ovociti umani ma sono considerevolmente pi� piccoli di quelli umani e di conseguenza � possibile aspettarsi un diverso comportamento, su base cinetica, in risposta alla presenza del crioprotettore. Gli ovociti umani tendono a ridursi pi� di quelli murini e a mostrare valori pi� elevati per unit� di volume, a parit� di condizioni, per quanto riguarda la permeabilit� all�acqua e ai crioprotettori (Paynter S.,2001) Gli ovociti umani sono pi� permeabili al propandiolo che al DMSO, mentre per quelli murini la risposta ai due crioprotettori � pressocch� identica (Paynter S.,1997)

43. Permeability coefficients of murine oocytes exposed to 1.5 mol/l cryoprotectant (Paynter S. et al.2005) Lp= water permeability Ps= solute permeability

44. Permeability coefficients of oocytes exposed to 1.5 mol/l propane-1,2-diol (Paynter S. et al.2005) Lp= water permeability Ps= solute permeability

45. Qualit� ovocitaria Migliore � la qualit� dell�ovocita destinato alla crioconservazione maggiore � la sua probabilit� di sopravvivere dopo lo scongelamento.

46. Et� dell�ovocita Gli ovociti dovrebbero essere congelati poco dopo il pick-up, tra le 38 e le 40 ore dopo la somministrazione di hCG (Chen C.,1987) e comunque entro 8 ore dalla raccolta (Gook D.,1994). La crioconservazione di ovociti �datati� � correlata ad un decremento del tasso di fertilizzazione e ad un aumento della poliploidia (Gook D.,1994).

47. Stadio di maturazione Un� alternativa alla conservazione di ovociti maturi � il congelamento di ovociti in profase I con i cromosomi racchiusi all�interno del nucleo della cellula. Dopo i primi risultati poco incoraggianti, Hovatta O. (1996) ha proposto la crioconservazione di sottili sezioni di tessuto ovarico umano, ricco di follicoli primordiali, seguita dalla maturazione in vitro degli ovociti in essi contenuti e dalla successiva fertilizzazione. Altri Autori (Newton H.et al., 1996) hanno proposto il trapianto del tessuto ovarico scongelato nell�addome della paziente (trapianto ortotopico).

48. Il cumulo ooforo La rimozione del cumulo ooforo � stata supportata e criticata da diversi Autori. Gook et al. (1993) riportano pi� elevate percentuali di sopravvivenza post-scongelamento negli ovociti privati del cumulo (69% vs 48%), a sostegno dell�ipotesi che l�assenza del cumulo favorisca la penetrazione dei crioprotettori nel citoplasma cellulare. Al contrario, Imoedehme e Sigue (1992) suggeriscono il ruolo protettivo del cumulo nei confronti dello stress osmotico derivante dalla rapida concentrazione o diluizione dei crioprotettori rispettivamente durante le fasi di raggiungimento dell�equilibrio e durante quelle della rimozione post-scongelamento con percentuali di sopravvivenza ovocitaria del 54% vs il 27% in assenza di cumulo.

49. In vitro survival of cumulus-enclosed or cumulus- free human oocytes after vitrification by the Cryotop method using two different cryoprotectant concentrations compared with freezing by standard equilibrium cooling.(Kuwayama M.,2005) a,b,c Values with different superscripts within the same columns are significantly different D,e Cryoprotectants ethylene glycol and propylene glycol respectively

50. Il Citoscheletro Nell� ovocita maturo i cromosomi sono disposti sul fuso microtubulare la cui appropriata organizzazione � la base per il corretto allineamento, segregazione e distribuzione dei cromosomi dopo la fertilizzazione. Il fuso � una struttura sensibile al raffreddamento (Sathananthan A.H. et al.1992) anche se la situazione � reversibile qualora le cellule vengano riportate a 37�C per un tempo sufficiente. Nell� ovocita umano il danno pare irreversibile dopo un�esposizione a temperatura ambiente di 10-30� (Pickering S.J. et al. 1990); Uno studio sulla cinetica della distruzione del fuso � stato condotto su ovociti umani freschi allo stadio immaturo, maturati in vitro fino allo stadio di metafase II (Zenzes M.T. et al.2001). Dopo 1 min. a 0�C il danno del fuso era trascurabile, ma dopo 10� era completamente scomparso. Tuttavia , nonostante la depolimerizzazione a 0�C, i cromosomi non apparivano dispersi. Quindi i microtubuli associati ai cinetocori reagiscono al raffreddamento in maniera diversa rispetto ai microtubuli che passano fra i cromosomi attraverso la piastra metafasica; Il fuso microtubulare � sensibile all�esposizione ai crioprotettori. Gli ovociti umani esposti a propandiolo, in presenza e in assenza di congelamento , non presentano perdita di cromosomi nonostante la mancanza o l�anormalit� del fuso (Gook D.et al. 1993).

51. Diagram showing different rates of birefringence signal intensity at different time points after thawing

52. A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. (Boiso I. et al., 2002)

53. Effetto della crioconservazione sulla segregazione cromosomica

54. Use of fluorescence in situ to assess the chromosomal status of embryos obtained from cryopreserved oocytes. Cobo et al.,2001 *Differences between the two groups were not significative

55. A rational approach to oocyte cryopreservation(Paynter S.J.,Reprod. Biomed. Online 2005) Mean volume of human oocytes during exposure to 1.5 mol/l PrOH plus 0.1,0.2,0.3 mol/l sucrose, after exposure to 1.5 mol/l PrOH for 10� at r.t..

56. Procedura di congelamento ovocitario(Fabbri et al.2001) Le soluzioni di congelamento sono: 1) 1.5 mol/l PrOH + 30% PPS (supplemento proteico plasmatico) in PBS (equilibration solution); 2) 1.5 mol/l PrOH + 0.3 mol/l saccarosio + 30% PPS in PBS (loading solution); Tre ore dopo la rimozione del cumulo, gli ovociti vengono sottoposti a lavaggio in una soluzione salina tamponata (PBS)+ 30% PPS (supplemento proteico plasmatico) e quindi trasferiti in una Ia soluzione di congelamento dove permangono per 10� a t.a.. Segue il passaggio nella IIa soluzione per 5� a t.a.

57. Procedura di congelamento ovocitario(Fabbri et al.2001) Gli ovociti vengono caricati in paillettes di plastica e trasferiti in un congelatore biologico programmabile dove verranno congelati secondo il seguente programma: partendo da una temperatura iniziale di 20 �C, il raffreddamento procede alla velocit� di �2�C/min fino a �7�C. Il seeding viene indotto manualmente a � 7�C; dopo un intervallo di 10� a �7�C, le paillettes vengono prima raffreddate lentamente fino a �30 �C ad una velocit� di � 0.3 �C/min e quindi velocemente portate alla temperatura di �150 �C cui segue l�immersione in N2 liquido.

58. Procedura di scongelamento ovocitario(Fabbri et al.2001) Al congelamento lento fa seguito uno scongelamento rapido che prevede: Immersione delle paillettes in un bagno d� acqua a 30�C per 40s e recupero degli ovociti in esse contenuti; Rimozione graduale del crioprotettore a t.a. attraverso passaggio in una Ia soluzione contenente 1.0 mol/l PROH + 0.3 mol/l saccarosio + 30% PPS x 5� e successivo stazionamento in 0.5 mol/l PROH + 0.3 mol/l saccarosio + 30% PPS x 5�; Passaggio degli ovociti in una soluzione composta da 0.3 mol/l saccarosio + 30% PPS x 10� prima della diluizione finale in PBS + 30% PPS x 20� (10� a t.a. e 10� a 37 �C) e successivo trasferimento in terreno di coltura.

59. Percentuali di sopravvivenza post-congelamento di ovociti: Risultati estrapolati dai principali studi

60. In vivo development of the vitrified human oocytes after embryo transfer on day 2 and day 5. (Kuwayama M. et al.2005)

61. La fecondazione � influenzata dalla crioconservazione?

62. Percentuali di fecondazione di ovociti umani congelati e inseminati tramite FIV standard o ICSI

63. Il Problema della Riproducibilit�

64. Numero complessivo di gravidanze

65. CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI: LIMITAZIONI Ovociti in metafase II Rilascio prematuro dei granuli corticali Ispessimento della zona pellucida o danno meccanico Attivazione partenogenetica Aneuplouidia per danni al fuso meiotico Tasso di sopravvivenza post-scongelamento variabile dal 25% all� 80% Tasso di fertilizzazione variabile dal 13% al 71% Tassi di poliploidia variabili dal 5% al 15.3%. Ovociti immaturi (VG) Scarsi risultati in termini di PR dopo maturazione �in vitro� Tasso di sopravvivenza post-scongelamento pari al 40% Percentuale di maturazione �in vitro� pari al 24%.

66. Crioconservazione del tessuto ovarico Il tessuto ovarico � una matrice complessa di follicoli a vari stadi maturativi, che racchiudono ovociti a vari stadi di sviluppo, circondati da una popolazione di cellule fisiologicamente importanti, le cellule tecali e della granulosa. Il congelamento del tessuto deve essere in grado di preservare la vitalit� di queste cellule in modo da consentire la ripresa della crescita dopo scongelamento ed eventuale impianto come tessuto reinnestato.

67. CRIOCONSERVAZIONE DEL TESSUTO OVARICO: �IN VIVO� Trapianto ortotopico Recupero della funzione riproduttiva Fertilit� naturale e concepimento Trapianto eterotopico Autoinnesti, xenoinnesti Recupero ovocitario ART: FIV/ICSI � ET e HA

68. CRIOCONSERVAZIONE DEL TESSUTO OVARICO: �IN VITRO� Coltura dei follicoli Crescita �in vitro� Maturazione �in vitro� Riproduzione assistita: IVF-ICSI, Embryo transfer e �hatching� assistito.

69. Crioconservazione di tessuto ovarico per trapianto: stato dell� arte Nel 1994 Harp e coll. congelano con successo tessuto ovarico di topo utilizzando il DMSO come crioprotettore; Nello stesso anno Gosden e coll. conseguono il ripristino della fertilit� e la nascita di un agnello dopo autotrapianto di sezioni di tessuto ovarico, recuperato e congelato con DMSO a �196�C nell�ovaio di un accettore ovariectomizzato; Nel 1995 Gosden e Hovatta propongono la crioconservazione del tessuto ovarico e il successivo autotrapianto come soluzione al problema del ripristino della fertilit� in pazienti oncologiche; Nel 1996 il DMSO viene sostituito con l�1-2 Propandiolo associato a un protocollo di congelamento lento; Nel 1999 Gook e coll. optmizzano il protocollo di congelamento esponendo le sezioni di corticale a trattamento con 1-2 Propandiolo in combinazione con saccarosio (0.1M) per 90� a temp. ambiente.

70. Crioconservazione del tessuto ovarico per trapianto: stato dell�arte Nel 1999 Weissman e coll. propongono lo xenotrapianto di frammenti di corticale umana sotto la pelle di topi immunodeficienti per lo sviluppo di follicoli antrali dietro controllo di gonadotropine esogene; Nel 2001 Gook e coll. ottengono lo sviluppo di follicoli antrali dopo impianto di tessuto ovarico umano sotto la capsula renale di topi immunodeficienti; Nel 2001 il primo tentativo di applicazione clinica di crioconservazione di tessuto ovarico in paziente affetta da linfoma di Hodgkin con ripristino della funzione ovarica dopo circa 9 mesi (Radford e coll.)

71. Crioconservazione del tessuto ovarico come fonte di ovociti Nel 1996 Eppig e coll. mettono a punto un sistema di coltura che consente la maturazione in vitro di follicoli immaturi isolati dal tessuto ovarico di topo con produzione di ovociti maturi in grado di essere fertilizzati e di dare origine a individui vivi; Partendo dal dato che il tessuto ovarico umano � pi� denso e fibroso di quello dei piccoli mammiferi, Oktay e coll.(1997) propongono la digestione enzimatica dei frammenti di corticale dopo crioconservazione praticata con propandiolo e congelamento lento; Nel 1998 Oktay e coll. ottengono lo sviluppo di follicoli primordiali umani fino allo stadio antrale nella capsula renale di topi immunodeficienti trattati con FSH; Nel 2000 Stzein e coll. nel topo recuperano il tessuto ovarico congelato e subito dopo lo scongelamento isolano gli ovociti dai follicoli antrali. Questo approccio non � stato ancora applicato in campo umano.

72. Crioconservazione del tessuto ovarico: il futuro