Download
1 / 38
390 likes | 410 Views
CENTRO UNIVERSITÁRIO DINÂMICA DAS CATARATAS Medicina Veterinária. Transgênese. Professora: Ana Luiza Cazaux. Foz do Iguaçú 2018. Transgênese. Definição mais antiga
E N D
CENTRO UNIVERSITÁRIO DINÂMICA DAS CATARATAS Medicina Veterinária Transgênese Professora: Ana Luiza Cazaux Foz do Iguaçú 2018
Transgênese • Definição mais antiga Animais transgênicos são produzidos através da introdução de DNA "exógeno" em embriões pré-implantacionais. O DNA exógeno é inserido no material genético e é expresso em todos os tecidos do indivíduo resultante, de modo que ele possa se expressar no animal adulto e ser transferido a sua descendência.
HOJE – DEFINIÇÃO DE TRANSGÊNICO A Federação Europeia das Associações de Ciência em Animais de Laboratório denomina como transgênico: Animal que possui seu genoma modificado artificialmente pelo homem, quer por meio da introdução, quer da alteração ou da inativação de um gene (uma sequência definida de DNA). Esse processo deve culminar na alteração da informação genética contida em todas as células desse animal, até mesmo nas células germinativas (óvulos e espermatozoides), fazendo com que essa modificação seja transmitida aos descendentes. O gene modificado pode ser originário da mesma espécie, de uma espécie diferente ou mesmo de bactérias ou plantas. Em qualquer dos casos, ele é denominado transgene e o processo de manipulação das técnicas envolvidas nesse processo é chamado transgênese
HOJE – ANIMAIS TRANSGÊNICO Engloba animais que tiveram genes adicionados (transgênicos por adição), modificados (knockin) ou retirados (knock-out)
Produção de animais domésticos transgênicos Método para introduzir rapidamente "novos" genes ou mesmo para modificar ou retirar determinados genes em bovinos, suínos, ovinos e caprinos, na ausência de cruzamentos. Parece ser + extrema essência, não difere muito de cruzamentos ou seleção genética.
Objetivo da biotécnica de transgênese em animais • Produzir animais que possuam uma incorporação estável de fragmento de DNA exógeno em sua linhagem germinativa. Indivíduos funcionam como "fundadores" de rebanhos, para gerar várias progênies portadoras de um ou mais genes desejáveis.
Histórico • Jaenisch & Mintz (1974) • Primeiros animais a carregarem genes inseridos experimentalmente foram camundongos produzidos pela injeção de DNA de vírussímio 40 (SV40) na cavidade (blastocele) de blastocistos. • No entanto, não incorporaram o DNA de SV40 em suas células germinativas • Jaenisch et al. (1983) • Incorporação em células germinativas • Exposição de embriões murinos a uma cepa infectante do vírus leucemia Moloney • Primeira linhagem de camundongos transgênicos
POR QUE PRODUZIR ANIMAlS TRANSGÊNICOS??? • Para se obter novos conhecimentos • Para decifrar o código genético • Para estudar o controle genético dos sistemas fisiológicos • Para construir modelos genéticos de doenças, • Para melhorar caracteres produtivos animais e • Para produzir novos produtos animais.
Aplicações práticas da transgênese na produção animal incluem: • Produção de proteínas recombinantes no leite - Animais biorreatores • Mudanças na composição do leite • Aumento na produção de leite e carne - Acelera o progresso zootécnico • Aumento da resistência à doenças
Aplicações práticas da transgênese na produção animal incluem: • Aumento na prolificidade • Melhor conversão alimentar e aumento nos índices de crescimento • Melhor composição de carcaça, • Maior flexibilidade na manipulação genética direta de espécies domésticas
Aplicações práticas da transgênese na produção animal incluem: • Aumento na performance reprodutiva • Criação de modelos animais para doenças em humanos • Produção de animais doadores de órgãos
RESUMINDO!!! • A adição de um gene humano a um embrião animal pode resultar num modelo transgênico com características específicas de uma doença humana • Modelo experimental valioso para o teste de vacinas e agentes farmacológicos. • Desativação de um gene nas células embrionárias pode levar ao nascimento de um camundongo nocaute • Modelo para se entender como as mutações produzem as malformações e os defeitos congênitos. • Transgenia animal tem contribuído para a pesquisa de diversas doenças, incluindo aquelas de origem complexa e difícil cura, como câncer, diabetes, hipertensão, Alzheimer, deficiências imunológicas e distrofias musculares, entre outras.
Geração de um animal transgênico • Vários métodos disponíveis • Emprego depende do tipo de modificação genética que se deseja • introdução, • modificação ou • inativação de um gene - knockout. • Método mais utilizado na introdução de genes • Transgenia por adição - são inseridas no genoma uma ou várias cópias de um gene de interesse, endógeno ou exógeno.
Genes endógeno X exógenos • Genes endógeno • Existe no genoma do animal, • Usado quando se quer produzir uma quantidade maior da proteína codificada já existente, aumentando a quantidade de cópias dele no genoma. • Genes exógenos • Pertencem à outra espécie • Usados para fazer um animal produzir uma nova proteína, ausente na forma desejada na espécie receptora.
Técnicas de Transgênese • Microinjeçãopronuclear • Transferência de DNA por retrovírus • Injeção de células tronco embrionárias e/ou células germinativas embrionárias, previamente expostas a DNA exógeno, na cavidade de blastocistos, • Transferência de DNA mediada por espermatozoides durante a fecundação in vitro
Técnicas de Transgênese • Transferência de DNA mediada por lipossomas a células de embriões • Eletroporação de DNA a espermatozoides, oócitos ou embriões • Transferência nuclear com células somáticas, tronco ou germinativas embrionárias transfectadas • Injeção de DNA em testículos para produzir células tronco espermatogênicas transgênicas.
Microinjeçãopronuclear - Oócitosóvulos são coletados de animais que foram “superovulados” e fertilizados in vitro, produção de embriões recentemente fecundados.
Microinjeção pronuclear • Principal método utilizado atualmente para produzir animais geneticamente modificados. • Injeção de 200 a 300 cópias do gene exógeno em oócitos recém-fertilizados seguido da implantação posterior dos mesmos em mães de aluguel. • Pequena porcentagem dos animais nascidos é transgênica • Apenas uma porção deles expressa o gene adicionado a um nível suficientemente detectável.
Microinjeçãopronuclear • Animais nascidos (animais fundadores) • Acasalados com animais não transgênicos - produz animais que são heterozigotos (híbridos) para o gene. • Animais heterozigotos (Aa) podem ser acasalados entre si. • Obtenção de animais denominados homozigotos (AA) para o gene exógeno.
Microinjeçãopronuclear • Vantagens • Eficiência relativamente alta para gerar linhagens de animais transgênicos • Índice de sucesso é de aproximadamente 30% em camundongos e de 1% a 10% nas espécies domésticas.
Microinjeçãopronuclear • Desvantagens • Baixa eficiência. • Método teve pouco progresso • Taxa de nascimento dos animais é baixa • Grande perda gestacional destes embriões, • De todos os embriões produzidos, 0 a 2% resultam em animais nascidos vivos e com a modificação desejada (transgênicos).
Retrovírus • Vírus que inserem uma cópia de DNA de seu próprio material genético, produzido a partir de um RNA modelo, no DNA da célula hospedeira após infecção. • funciona como um sistema natural de transferência para introduzir DNA em vários tipos de células de mamíferos
Retrovírus • Vantagem - facilidade técnica • Limitação • o gene é inserido de forma aleatória no genoma. • DNA pode se localizar em regiões diferentes e em diversas células • Necessita-se fazer vários acasalamentos de indivíduos geneticamente independentes para se obter indivíduos de linhagem pura.
Injeção de células tronco embrionárias • Preferencialmente usado quando se quer direcionar a inserção de um gene (gene targeting) em um determinado local (ou loco) do genoma. • Cultivo de células-tronco embrionárias • Utilização de vetores para a promoção de modificações genéticas específicas nessas células • Remoção ou substituição de um gene escolhido • Troca de uma única base dentro do código genético por outra.
Injeção de células tronco embrionárias • As células-tronco embrionárias (4 a 5 células) que foram modificadas são injetadas dentro de um blastocisto (embrião em fase inicial do desenvolvimento) • Embrião implantado no útero de uma fêmea receptora cuja pelagem é diferente da do animal que deu origem a célula-tronco • Filhotes resultantes dessa gestação poderão ser animais do tipo quimérico ou misto (esta mistura genética - todos os órgãos, inclusive nas gônadas). • Necessário vários acasalamentos entre animais quiméricos para se selecionar aqueles com as novas características genéticas introduzidas (cor da pelagem) • Método é utilizado em camundongos • Difícil estabelecer estabelecer linhagens de células-tronco embrionárias de bovinos, ovinos e suínos
Injeção de células tronco embrionárias • Utilizada para fazer o nocaute de um gene • Embrião resultante contém duas linhagens celulares distintas, uma proveniente das células-tronco do blastocisto doador e outra originária do blastocisto receptor. • Primeiros neonatos provenientes destes embriões são denominados de quimeras (compostos de 2 ou + genótipos distintos), que cruzados entre si, podem gerar o animal nocaute ou knock-in. • Os animais são denominados nocautes, já que a modificação genética introduzida é capaz de interromper ou anular um gene que, então, não mais se expressa, sendo denominado de nocauteado
Injeção de células tronco embrionárias • Vantagens • CTE podem ser mantidas in vitro por várias gerações, produzindo números ilimitados de células idênticas • TE podem ser transformadas in vitro com DNA exógeno • linhagens de CTE podem ser isoladas e derivadas a partir de uma única célula • CTE transformadas podem ser avaliadas e selecionadas para a incorporação de DNA exógeno antes de serem usadas para produzir embriões quiméricos ou clonado • todos os tecidos da progênie quimérica gerada a partir de CTE carregam o transgene num sítio idêntico do genoma; • produção de transgênicos a partir de linhagens de CTE transformadas com DNA, avaliadas e derivadas individualmente, permitiria a produção de um grande número de animais geneticamente idênticos; • Eficiência da produção de animais transgênicos pode ser aumentada a expressão em um tecido específico de um gene inserido pode ser detectada antes de se introduzir CTE nos embriões
Técnicas de Transgênese • Vetor espermatozoide - Ligação com DNA - Suspensão de espermatozóides - Injeção testicular DNA - FIV, IA - Simples - Eficiência
Identificação dos Transgenes • PCR • Hibridização in situ • Endonuclease de restrição S1 S2 A1 A2
Limitações • Expressão desregulada de genes, resultando na produção excessiva ou reduzida dos produtos gênicos; • Número muito alto de cópias resultando em expressão excessiva dos produtos; • Efeitos colaterais possíveis, tais como artrite, crescimento esquelético anormal, cardiomegalia, dermatite, úlceras gástricas e patologia renal, encontradas em suínos transgênicos para hormônio de crescimento humano; • Mutações de inserção, que resultam na alteração de processos biológicos essenciais; • Transmissão do transgene para apenas alguns animais da progênie; • Integração do transgene num cromossomo sexual, que resulta em apenas um sexo carregando o transgene.
