Fingerprinting techniky

1. Fingerprinting techniky (molekulární daktyloskopie)

2. Obsah • Princip metod • Charakter získaných dat • Typy metod • Proteiny • DNA-fingerprinting • AFLP

3. Princip metody • Metoda „Hrubé síly“ • Získat velké množství molekulárních znaků • Neověřovat jejich nezávislost • Neověřovat jejich genetické pozadí

4. Charakter získaných dat • Multilokusová data • Distanční metody • Fenetické metody? • U vzdálenějších druhů vadí vysoké procento homoplasií • Genetická identita, genealogická příbuznost, tokogeneze, fylogeneze příbuznějších taxonů

5. Obsah • Princip metod • Charakter získaných dat • Typy metod • Proteiny • DNA-fingerprinting • AFLP

6. Typy metod • Rozdělení podle studovaných molekul • Proteiny • DNA • Rozdělení podle výchozího materiálu • Rozdělení podle metody frakcionace • Rozdělení podle metody detekce

7. Proteinový fingerprinting Princip metody • Izolovat směs proteinů • Předfrakcionovat • Separovat (elfo) • Detekovat

8. Proteinový fingerprinting • Komplexita výchozího materiálu • Nativní materiál (sérum, bílek, homogenát) • Extrakty (fenolový extrakt, vodný extrakt) • Způsob separace • Elfo (PAGE, nitrocelulosa, agar) • Metoda detekce • Nespecifické barvení (CBB, stříbro) • Semispecifické barvení (stříbro kovy) • Specifické histochemické barvení (isozymy)

9. Proteinový fingerprinting Proteinové extrakty z různých kultivarů pšenice rozděleny na PAGE a obarveny CBB

10. Izoenzymová analýza Homogenát tachyzoitů Toxoplasma gondii

11. Výhody protein fingerprinting • Relativně jednoduché a rychlé • Kodominance znaků • Zavedená metoda

12. Nevýhody protein fingerprinting • Méně znaků • Znaky mohou být selekčně významné • Možnost ovlivnění i prostředím • Materiál méně stabilní

13. DNA fingerprinting • RFLP restriction fragment length polymorphism • scnRFLP restriktasa fingerprinting na scnDNA • RAPD Random Amplified Polymorphic DNA • AP-PCR arbitrarily primed PCR • AFLP amplified fragments length polymorphism

14. DNA fingerprintingPrincip metody • Izolovat DNA • (snížit komplexitu) • Nasegmentovat DNA (restriktázy, PCR) • Separovat segmenty • Detekovat

15. b a c _ _ _ + + + taxoprint RFLP RAPD

16. RFLP • Nastříhání DNA pomocí restrikčních endonukleáz • Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich kombinace • Problémy s přílišnou komplexitou vzorů • Snížení komplexity výchozí DNA • Kvalita separace fragmentů • Specifičnost detekce zón

17. RFLP bakteriální DNA Celková DNA po naštěpení rozdělena na PAGE a obarvena EtBr

18. RFLP bakterií (taxoprint) DNA rozštěpena, koncově označena, rozdělena na PAGE a detekována; autoradiograficky

19. RFLP chloroplastové DNA Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a obarvena EtBr

20. scnRFLP PCR-amplifikovaných úseků cpDNA

21. RFLP mtDNA rostlin - krok 1 Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr

22. RFLP mtDNA rostlin - krok 2 DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizována s mtDNA sondou a detekována autoradiograficky

23. DNA-fingerprint ptačí DNA DNA rozštěpena enzymy, rozdělena na agarosové elfo, přeblotována na nylonovou membránu a detekována 33.15 sondou

24. Výhody RFLP • Relativní jednoduchost a láce • Velké množství dat • Slušná reprodukovatelnost • Kodominance znaků • Multilokusový charakter • Selekční neutralita znaků

25. Nevýhody RFLP • Potřeba většího množství DNA • Potřeba kvalitnější a čistší DNA • Spíše pro příbuzné druhy • Někdy špatně čitelné elektroforetogramy – nutnost snižovat komplexitu DNA • Znaky nemusí být nezávislé • RAPD z technického hlediska lepší

26. RAPDPrincip metody • Izolovat DNA (hlavně vyčistit) • Amplifikovat fragmenty pomocí náhodných PCR primerů • Rozdělit fragmenty • Detekovat fragmenty

27. RAPD Random Amplified Polymorphic DNA • Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů • Různé modifikace AP-PCR • Různé metody zvyšování počtu znaků • Kombinace primerů • Restrikce enzymy • Semiselektivní primery • Transposomy • Introny exony

28. RAPD DNA kvasinek Po amplifikaci s náhodnými primery byly produkty PCR rozděleny na agarosové elfo a detekovány EtBr

29. RAPD myši DNA byla před amplifikací štěpena restrikčním enzymem, PCR primery hybridizovaly s ALU

30. Výhody RAPD • Cena • Rychlost • Univerzálnost • Malé množství materiálu • Nižší požadavky na kvalitu DNA • Obrovské (libovolné) množství dat • Kvalita elektroforetogramů

31. Nevýhody RAPD • Typická fingerprinting metoda • Nelze hodnotit znakově orientovanými metodami • Použitelné jen u relativně příbuzných druhů • Chybí kodominance • Interference znaků • Vliv kontaminující DNA • Nízká reprodukovatelnost PCR • Horší publikovatelnost výsledků

32. AFLP (amplified fragments length polymorphism) EcoRI Restrikce dvěma enzymy MseI EcoRI adapter EcoRI adapter MseI adapter Ligace adaptérů Předselkční primery Předselektivní PCR Selekční primery Selektivní PCR

33. AFLP 2 kapilárová elektroforéza standard molekulární váhy amplifikované fragmenty

34. Výhody AFLP • Vysoká reprodukovatelnost výsledků • Velké množství znaků • Kodominance znaků • Minimum falešných homologií • Lze použít znakově orientované metody • Dobrá publikovatelnost výsledků

35. Nevýhody AFLP • Nákladnost kitů i přístrojového vybavení • Složitost metody • Spíše pro příbuzné druhy

36. Závěry • Fingerprinting techniky velmi vhodné pro vnitrodruhové studie a pro fylogenetiku na nižší taxonomické úrovni • Výhodná cena a rychlost • Multilokusový charakter dat • Data zpracovávat distančními metodami! • Nejvýhodnější z hlediska výsledků RAPD, z hlediska publikovatelnost AFLP