Genómica

1. Genómica Licenciatura em Ciências Biomédicas Departamento de Ciências da Saúde, UCP Fevereiro 2013

2. Sumário 3. Montagem de genomas • Montagem hierárquica • Montagem de genomas completos • Montagem de genomas com base em modelos • Problemas associados à montagem dos genomas • Controlo de qualidade Genómica 12-13 MJC

3. Montagem de genomas • Após a sequenciação temos fragmentos (de tamanhos que vão de 1000 a 40 pbs) que é preciso reordenar na sequência original. Sobreposições em média de duas centenas de pares de bases. Equivale a ter um puzzle de 30 milhões de peças Aumenta o número de peças para 2-3 triliões. Genómica 12-13 MJC

4. Algumas das peças… • Faltam • Problemas na construção das bibliotecas • Problemas com a amplificação por PCR • Têm erros • Zonas repetitivas • Erros no PCR Aumentamos o nº de vezes que cada peça é sequenciada! Entre 8 e 100 vezes Genómica 12-13 MJC

5. A sequência (read) ideal • É longa • Não tem erros (tem bons algoritmos de “base calling”). Genómica 12-13 MJC

6. Podemos considerar 2 tipos • Única (single read) • Resulta da sequenciação do fragmento em si. • Emparelhada (pairedread) • Nestas leituras eu sei a sequência das pontas e a que distância estão uma da outra. Genómica 12-13 MJC

7. Tendo as sequências o desafio é ordená-las Genómica 12-13 MJC

8. Genómica 12-13 MJC

9. A forma como a montagem é feita • Depende de haver ou não um genoma de referência: • Se há usa-se como modelo • Se não há deve usar-se outras informações como informações do exoma por exemplo. Genómica 12-13 MJC

10. Alguns algoritmos de montagem Genómica 12-13 MJC

11. Problemas na montagem de short reads • E as que não “encaixam”? • Sequencias repetidas no genomade referência? • Errosd de sequenciação • Balanço entre encontrar o emparelhamento e gerar o mapa? • É assim tão importante que encaixem todas as reads? • A capacidade/ resultados dependem não só do algoritmo usado como dos parâmetros descritos para cada algoritmo. Genómica 12-13 MJC

12. Quando a montagem é de novo Genómica 12-13 MJC

13. Montagem hierárquica ou de clones Genómica 12-13 MJC

14. Abordagem usada para alinhar grandes inserções clonadas • Primeiro é feito o mapeamento dos clones por padrões de digestão,marcadores de linkageou mutações induzidas. Genómica 12-13 MJC

15. Dessemapeamento…. • Escolhem-se os fragmentos a vermelho pois implicam a menor sobreposição. • É feita a sequenciação desses fragmentos: • Cada sequenciação (read) é avaliada quanto à sua qualidade. • É reconstruida a sequencia inicial usando as sobreposições. Genómica 12-13 MJC

16. Montagem de genomas completos Genómica 12-13 MJC

17. Métodomaisaplicadoatualmente • Uma vezque a maioria da sequenciaçãojánãoimplicaclonagem. • Dispensa o passo do mapeamento. • São sequenciadas as extremidades dos váriosfragmentosquesãodepoisalinhadas. Genómica 12-13 MJC

18. Desse alinhamento surge o “contig” • Inclui 3 fases: • Sobreposição • Alinhamento • Consenso Genómica 12-13 MJC

19. Desse alinhamento surge o “contig” A localização vai ser determinada pela homologia Genómica 12-13 MJC

20. Várioscontigsdão um scaffold Genómica 12-13 MJC

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22. Alguns algoritmos de montagem de genomas Genómica 12-13 MJC

23. Greedy • Como a homologia é a única condição este tipo de algoritmos é muito influenciado pelas sequências repetitivas ou homologias. Genómica 12-13 MJC

24. Overlap-Layout-Consensus • Todas as sobreposições são mapeadas (Overlap) • É eliminada a informação redundante (Layout) • Usando a teoria de grafos é desenhado o mapa mais simples e que corresponderá à organização inicial. Genómica 12-13 MJC

25. Overlap-Layout-Consensus • Pode ser substituído pelo: Align-Layout-Consensuspois já há vários genomas de referência sequenciados. Genómica 12-13 MJC

26. Controlo de qualidade Genómica 12-13 MJC

27. Em genomas de novo • Não se sabe quase nada • Nº de scaffolds e contigs que representam o genoma. • A proporção de reads queconsegueser • O comprimento dos contigs e scaffolds relativamenteaocomprimento do genoma. Genómica 12-13 MJC

28. N50 • Tamanho do contig mais curto acima do qual se inclui 50% do genoma. Genómica 12-13 MJC

29. Os vários algoritmos devem ser comparados • Foi feita uma comparação no artigo GAGE: Genómica 12-13 MJC

30. O algoritmo deve ter em conta • Dependendo do organismo • Tamanho diferente dos genomas • Heterozigotia diferente • Humanos (1 par de bases pair/1000) • Lesmas do mar 1/50–100 Genómica 12-13 MJC

31. Independentemente do algoritmo… • Entra lixo • Sai lixo • Muitos sequenciadores têm controlos de qualidade para contaminações, quimeras e erros de leitura. Genómica 12-13 MJC

32. Montagem comparativa Genómica 12-13 MJC

33. Genomas de referência Genomas de mesma espécie ou espécies semelhantes que servem de modelo. Os algoritmos tentam alinhar as sequências obtidas ao que já está sequenciado Genómica 12-13 MJC

34. Problemas na Montagem de Genomas Genómica 12-13 MJC

35. Dificuldades • Contaminação • Sequênciasquenãopertencemaogenomaque se quersequenciar. • Erros de montagem • As sequênciasrepetidaspodeminduzirosalgoritmos de montagememerro. As secçõespodemsermontadascomomaiscurtasousobrepostaspeloquedesaparecem do genoma final. • Homologiaemgrandeescala. • Nosgenomas dos mamíferosházonas com umagrandepercentagem de homologia (>90%) mas quesãozonasdiferentes do genoma. Como a homologiaéusadaparafazerosalinhamentos as montagensficammalfeitas. • Polimorfismogenómico • Dado quemuitosgenomassãopoliploides a montagem de genomasmuitasvezesnãoconseguedistinguirestespolimorfismoscomopossibilidadesalternativas do mesmo locus. Genómica 12-13 MJC

36. Efeito das zonas repetidas Genómica 12-13 MJC

37. Genómica 12-13 MJC

38. Bibliografia • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/assembly.shtml • http://www.cbcb.umd.edu/research/assembly_primer.shtml • Artigo: de novo genomeassembly; GAGE ambos na pasta Genómica 12-13 MJC