Download
1 / 18
E N D
Transkriptsiooni elongatsioon Erinevalt transkriptsiooni initsiatsioonist pole üldjuhul elongatsiooniks vajalike faktorite seondumine RNA polümeraasiga selges järjekorras reguleeritud. Seondumised käivad valdavalt CTD kaudu ning samaaegselt võivad kohal olla mitmed erinevad faktorid, millest osasid ei lähe võibolla üldse vaja. On siiski mõned, ilma milleta läbi ei saa. Polümeraasi teele võib jääda mitmeid takistusi, näiteks nukleosoomid (ja ka kõrgemad kromatiini struktuurid) või teised DNA-le seondunud valgud, samuti DNA vigastused. Need kõik põhjustavad RNA polümeraasi lühemat või pikemat peatumist ning sellistest olukordadest ülesaamiseks on olemas mitmeid abifaktoreid. Katkeid RNA polümeraasi töös jaotatakse vastavalt nende iseloomule ja pikkusele: paus, arest, või terminatsioon. Pausi all mõeldakse olukorda, kus RNA polümeraas ei lisa uut nukleotiidi RNA ahelasse ja jääb mõneks ajaks seisma. Sisuliselt tähendab see seda, et RNA vaba 3’ ots on veidi aktiivtsentrist välja nihkunud. Polümeraas saab pausist mõne aja jooksul ise üle, abifaktorid põhiliselt kiirendavad seda protsessi. Pausid esinevad kõikide RNA polümeraaside töös (kaasa arvatud bakterite ja viiruste RNA polümeraasidel).
Transkriptsiooni elongatsioon Aresti all mõeldakse olukorda, kus polümeraas on sunnitud peatuma pikemaks ajaks ja palju mõjuvamatel põhjustel. Näiteks siis, kui RNA ahelasse lülitatakse ekslikult vale nukleotiid. Aresti korral ei suuda polümeraas omade jõududega olukorrast välja tulla, vaid selleks on vaja lisafaktorite sekkumist. Üldiselt tähendab arest ka seda, et juba sünteesitud RNA ahelat hakatakse 3’ otsast lagundama ning polümeraas peab liikuma tagasi. Terminatsioon on olukord, kus RNA polümeraas katkestab transkriptsiooni lõplikult, vabastab sünteesitud RNA ning tuleb ka ise DNA küljest lahti.
Elongatsioonifaktorid TFIIF – faktor, mis on vajalik nii initsiatsioonil kui ka elongatsioonil, koosneb kahest subühikust, millest üks, RAP74, fosforüleeritakse TFIIH poolt transkriptsiooni üleminekul initsiatsioonist elongatsioonile. TFIIF on eriti oluline elongatsiooni algusfaasis, mil polümeraas lahkub promootorilt ning RNA ahel pole veel eriti pikk. See on olukord, kus sünteesitava RNA ots võib suhteliselt kergelt nihkuda eemale polümeraasi aktiivtsentrist ning TFIIF ülesanne on säilitada polümeraasi aktiivset konformatsiooni. Tõenäoliselt ei liigu TFIIF polümeraasiga kaasa kogu elongatsiooni vältel, kuid võib RNA polümeraasi kompleksiga uuesti seonduda, kui esinevad pausid polümeraasi töös. Elongiinid. Valgukompleks, mis koosneb kolmest subühikust: Elongiin A, B ja C. Transkriptsiooniliselt aktiivne on subühik A, teised omavad regulatoorset tähtsust. Sarnaselt TFIIF-ga aitab elongiin A polümeraasil pausist üle saada, suunates sünteesitava RNA 3’ otsa tagasi polümeraasi aktiivtsentrisse. TFIIF ja elongiin teevad sisuliselt samasugust tööd ning tõenäoliselt ongi nende funktsioon transkriptsiooni elongatsioonil dubleeritud. Võimalik, et elongiin on varuvõimalus juhuks, kui TFIIF kas ei jõua või ei saa seonduda peatunud polümeraasiga. Elongiinid B ja C võivad olla olulised, kui selgub, et paus polümeraasi töös pole lihtsasti ületatav (näiteks on paus põhjustatud DNA vigastustest) ning siis võivad elongiinid B ja C osaleda RNA polümeraasi kompleksi lagundamisel ja eemaldamisel kahjustatud DNA piirkonnast.
Elongatsioonifaktorid ELL valgud. Inimesel on kaks sarnast ELL valku, Drosophilal üks, lisaks on olemas veel kolm ELL-iga seonduvat valku, mis kokku moodustavad ELL kompleksi. ELL täidab üldjoontes samu funktsioone, mis TFIIF ja elongiinid, kuigi nende funktsioonid pole täielikult kattuvad. Drosophila ELL geeni deleteerimine on letaalne, näidates, et teised faktorid ei suuda kõiki ELL-i funktsioone dubleerida. On täheldatud, et ELL on oluline just väga pikkade geenide transkriptsiooniks. Seega ilmselt on ELL-i vaja eelkõige promootorist ja initsiatsioonikompleksist kaugel toimuvateks protsessideks. P-TEFb (positive transcription elongation factor b) kosneb kahest subühikust, millst üks on Cdk9 ning teine on kas tsükliin T1, T2a, T2b, või K. P-TEFb on kinaas, mis fosforüleerib RNA polümeraasi CTD Ser2-e. Tõenäoliselt on P-TEFb peamine roll hoida elongeeruv polümeraas fosforüleerituna ning tagada seeläbi teiste oluliste faktorite seondumine polümeraasiga. P-TEFb fosforüleerib ka valku Spt5, mis on DSIF-i subühik. DSIF (DRB-sensitivity inducing factor) on heterodimeer koosnedes valkudest Spt4 ja Spt5. Arvatavasti on DSIF vajalik enneaegse terminatsiooni vältimiseks.
Elongatsioonifaktorid NELF koosneb viiest subühikust, NELF-A, -B, -C, -D ja –E ning on negatiivseks elongatsioonifaktoriks, mis soodustab RNA polümeraasi peatumist. NELF ei seondu polümeraasiga otse, vaid läbi DSIF-i. Kui DSIF-i pole, siis NELF polümeraasile mingit mõju ei avalda. DSIF-i fosforüleerimine P-TEFb poolt takistab NELF-i seondumist RNA polümeraas ja DSIF-i kompleksile. Arvatavasti on DSIF/NELF süsteemiga indutseeritud transkriptsiooni paus oluline elongatsiooni algusfaasis, kus värskelt sünteesitud RNA peab läbima esimese olulise modifikatsiooni: CAP struktuuri lisamise 5’ otsa ning selleks protseduuriks on vaja veidi lisaaega. Samuti annab see paus aega ka teiste mRNA protsessinguks oluliste faktorite seondumiseks polümeraasi CTD-ga.
Elongatsioonifaktorid CSB (Cockayne Syndrome B) on põhiliselt küll DNA reparatsiooniga seotud valk, kuid sellel on roll ka transkriptsiooni elongatsioonil. Arvatavasti on CSB oluline transkriptsiooni käigus “avastatud” DNA kahjustuste äratundmisel ning sellest DNA reparatsioonisüsteemidele signaliseerimisel. CSB seondub otse RNA polümeraasiga ning mõjutab teise elongatsioonifaktori, TFIIS-i, aktiivsust. Kokkuvõtteks on CSB vajalik kahjustusega DNA parandamisel ja transkriptsioonil. TFIIS on sisuliselt ainuke faktor, mis võib päästa RNA polümeraasi transkriptsiooni elongatsiooni arestist. Aresti korral on RNA vaba 3’ ots nihkunud juba lootusetult kaugele polümeraasi aktiivtsentrist ning sellisel juhul aitab vaid see, kui RNA lühemaks lõigata ning jätkata sünteesi uuest 3’ otsast. Transkripti lõikab küll polümeraas ise, kuid TFIIS soodustab seda protsessi oluliselt. TFIIS-i seondumine polümeraasiga põhjustab suuri muudatusi polümeraasi konformatsioonis, mille tulemusena aktiveerubki polümeraasi võime RNA-d lühemaks lõigata.
Faktorid, mis mõjutavad kromatiini struktuuri On leitud, et nii in vitro kui in vivo aitavad ATP-sõltuvad kromatiini remodeleerivad faktorid SWI/SNF ja Chd1 RNA polümeraasil transkribeerida kromatiiniga kaetud DNA-d. SWI/SNF tuuakse kas otseselt või kaudselt geenide promootoraladele, kuid pole selge, kuidas võiks ta olla seotud transkriptsiooni elongatsiooniga ning nukleosoomide modifitseerimisega promootorist eemal asuvatel aladel. Chd1 seondub mitmete elongatsioonifaktoritega (näiteks DSIF ja Paf kompleks) ning teda ongi leitud eelkõige geenide kodeerivatelt aladelt, eriti aga 3’ piirkonnast. Võimalik, et Chd1 on vajalik kas DNA vabastamisel nukleosoomidest või siis kromatiini normaalse struktuuri taastamiseks peale transkriptsiooni. Chd1 sisaldab kromodomääni, mistõttu võiks eeldada, et ta seondub eelkõige metüleeritud histoone sisaldavate nukleosoomidega. Otsides veel faktoreid, mis võiksid soodustada polümeraasi elongatsiooni kromatiinil, avastati FACT kompleks (facilitates chromatin transcription). FACT koosneb kahest valgust: Spt16 ja SSRP1 (pärmis Pob3). FACT-i roll on ilmselt destabiliseerida nukleosoomi ning eraldada sellest H2A/H2B dimeer. Arvatavasti on FACT-il ka roll normaalse nukleosoomse struktuuri taastamisel peale seda kui transkriptsioon on lõppenud. FACT seondub DSIF, Spt6, Paf, Chd1 ja ka otse histoonidega.
Faktorid, mis mõjutavad kromatiini struktuuri Spt6 on valk, mis lokaliseerub samuti aktiivselt transkibeeritavatel aladel ning in ilmselt osaline normaalse nukleosoomse kromatiini struktuuri taastamisel pärast transkriptsiooni. Spt6 seondub spetsiifiliselt histooniga H3 ning on võimalik, et Spt6 ja FACT töötavad koos transkriptsiooni elongatsioonil. Nii FACT-i kui ka Spt6 puudumine rakus põhjustab transkriptsiooni initsiatsiooni transkribeeritavate geenide kodeeriva ala seest. See näitab, et nende faktorite puudumisel ei taastu normaalne kromatiini struktuur täielikult.
Mis saab nukleosoomidest? Tranaskribeeritavatel aladel toimub pidev nukleosoomide lagundamine ja uuesti moodustamine. On teada, et histoonide H2A-H2B dimeerid vahetuvad transkribeeritava ala nukleosoomides kogu aeg. Tõenäoliselt on selles roll FACT kompleksil, mis neid dimeere eemaldab. Pole päris selge kas ta ka osaleb otseselt uute H2A-H2B dimeeride tagasipanekul. Selge on see, et pärast transkriptsiooni lõppu sama dimeeri tagasi ei panda. H3-H4 tetrameer on märksa püsivam. Üldjuhul ei täheldata transkriptsiooni käigus histoonide H3 ja H4 väljavahetamist. Siiski on teada, et näiteks histooni H3 variant H3.3 lülitatakse kromatiini transkribeeritavatel aladel, samuti on teada, et väga tugeva transkriptsiooni korral (enamasti on tegu mõne indutseeritava geeniga), eemaldatakse nukleosoomid kogu transkribeeritava ala ulatuses. Pole teada, kas seda teeb RNA polümeraas ise või on selleks vaja ka mingeid lisafaktoreid. Teada see, et peale transkriptsiooni lõppu taastakse kromatiini struktuur väga kiiresti ning selles osaleb histoonide abivalk Asf1.
Faktorid, mis mõjutavad kromatiini struktuuri Elongeeruva RNA polümeraasiga seonduvad ka mitmed histoone modifitseerivad ensüümid. Neil ei ole otsest rolli RNA polümeraasi elongatsiooni mõjutamisel, küll aga on nad olulised transkribeeritava lookuse “märgistamisel”, millel omakorda võib olla oluline roll lisafaktorite seondumisel transkribeeritava alaga. Set1 ja Set2 on histoonide metüültransferaasid, mis seonduvad otseselt RNA polümeraasi CTD-le. Set2 metüleerib histooni H3 K36 ning kuna Set2 seondumine RNA polümeraasiga on otseselt seotud CTD fosforüleeritusega, siis kokkuvõtteks toimubki H3 K36 metüleerimine geenide kodeerivates osades. Set1 metüleerib H3 K4, mis on iseloomulik modifikatsioon geenide promootoritele lähematel aladel. Põhjus on ilmselt selles, et Set1 seondub eelistatult Ser5 fosforüleeritud CTD-ga ning selline polümeraasi fosforüleerimine toimub promootoril. Transkriptsiooniga kaasnevad histoonide metüleerimised võivad olla seotud teiste faktorite, näiteks kromatiini remodelleerija Chd1 lokaliseerimiseks transkribeeritavatele aladele. Või siis on see vajalik kellegi eemalhoidmiseks, näiteks histoonide deatsetülaasi kompleks NuRD ei seondu histoonidega, kui H3 K4 on metüleeritud.
Muud RNA polümeraasiga seondunud faktorid Paf1 kompleks (RNA polymerase associated factor 1) koosneb viiest valgust. Paf1 on oluline mitmete protsesside, eeskätt histoonide metüleerimise koordineerimisel. Paf1 on oluline nii Set1 kui Set2 histooni metüültransferaaside seondumiseks polümeraasiga. Samuti omab Paf1 rolli CTD fosforüleerimise regulatsioonil. Arvatavasti ongi Paf1 puhul tegu abifaktoriga, mille peamiseks ülesandeks on teiste faktorite kohaletoomine ja nende töö koordineerimine. FCP1 on peamine fosfataas, mis defosforüleerib CTD. Defosforüleerimine on vajalik eelkõige peale transkriptsiooni terminatsiooni RNA polümeraasi taaskasutusse saatmiseks.
mRNA protsessinguga seotud faktorid Kui sünteesitud mRNA on umbes 20-30 nukleotiidi pikk, siis toimub tema esimene modifitseerimine: 5’ otsa lisatakse CAP. CAP on struktuur, kus mRNA 5’ otsa on lisatud 5’-5’ sideme kaudu metüleeritud guanosiini (G) nukleotiid. See struktuur on oluline mRNA 5’ otsa kaitsmiseks nukleaaside eest ning seda struktuuri tunneb ära CBC kompleks (CAP binding complex), millest algab kasvava mRNA edasine pakkimine mRNA ja valkude kompleksiks. Selliselt pakituna transporditakse mRNA tuumast välja. Kõik CAP-i sünteesiks vajalikud ensüümid (RNA trifosfataas, guanülüültransferaas ja 7-metüültransferaas) seonduvad polümeraasi CTD-ga, mis on fosforüleeritud Ser5 positsioonist. Samal ajal on polümeraasiga seondunud NELF kompleks, mis aeglustab polümeraasi tööd ning annab aega CAP-i sünteesiks
mRNA protsessinguga seotud faktorid Lisaks CAP-i sünteesiks vajalikele ensüümidele seonduvad Ser5 fosforüleetitd CTD-ga ka mRNA 3’ otsa lõikamiseks ja polüadenüleerimiseks vajalikud ensüümid, mis liiguvad polümeraasiga kaasa kuni terminatsioonini. Guanülüültransferaas (GT) vabaneb CTD-lt ajaks, mil mRNA on kuni 500 nukleotiidi pikk, metüültransferaas (MT) jääb kompleksiga seotuks transkriptsiooni lõpuni. Nii GT kui MT stimuleerivad RNA polümeraasi elongatsiooni, seejuures MT teeb seda sõltumatult RNA metüleerimisest ja CAP struktuurist. RNA trifosfataas inhibeerib polümeraasi reinitsiatsiooni.
mRNA protsessinguga seotud faktorid Samaaegselt transkriptsiooniga toimub ka mRNA splaissing. Pole päris selge, kas selleks vajalikud faktorid tuukase kohale samuti läbi interaktsioonide CTD-ga, või tunnevad nad ära mRNA-d koos CBC kompleksiga. Võimalik, et transkriptsiooni varajases faasis tuuakse nad kohale CTD kaudu, kuid hiljem (kui on toimunud muudatused ka CTD fosforüleerimises) jäävad nad seondunuks ainult sünteesitava RNA-ga. Polümeraasi elongatsioon ja mRNA splaissing mõjutavad üksteist. On leitud, et intronitega mRNA-d transkribeeritakse efektiivsemalt kui ilma introniteta järjestust. Samuti on leitud, et polümeraasi elongatsiooni efektiivsus (liikumise kiirus) võib mõjutada alternatiivsete splaissingusaitide kasutamist.
mRNA 3’ otsa protsessing Transkriptsiooni terminatsioonil ja mRNA 3’ otsa protsessingul on oluline roll Poly(A) signaalil. See on RNA järjestus AAUAAA, mida tunnevad spetsiifiliselt ära transkripti lõikamiseks ja polüadenüleerimiseks vajalikud ensüümid. Sisuliselt tähendab mRNA 3’ otsa protsessing seda, et RNa lõigatakse katki umbes 10-35 nukleotiidi peale Poly(A) signaali ning saadud 3’ otsale lisatakse 200-250 adeniini (A) nukleotiidi. mRNA 3’ otsa protsessing koosneb kahest etapist: transkripti lõikamine ja polyA lisamine. Protsess algab sellest et CTD-ga seondunud CPSF (cleavage and polyadenylation specific factor) tunneb mRNA-l ära Poly(A) signaali ja seondub sellele. Sellisele kompleksile seonduvad omakorda CstF (cleavage stimulatory factor), mis tunneb mRNA-l veel ära GU rikast järjestust Poly(A) signaalist tagapool. Järgnevalt seonduvad CFI ja CFII (cleavage factor I and II). Aga enne kui mRNA katki lõigatakse, seondub ka veel PAP (Poly(A) polymerase). Tulemus on see, et kohe lõikamise järel toimub ka mRNA polüadenüleerimine.
Transkriptsiooni terminatsioon Transkriptsiooni terminatsiooni eelduseks on mRNA 3’ otsa lõikamine. • Terminatsiooni mehhanismina on välja pakutud kahte mudelit (mis võivad mõlemad õiged olla ja samaaegselt eksisteerida) • “Anti-terminaatori” mudel • “Torpeedo” mudel
