MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA

1. MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA Alberto José Prioli Sônia Maria Alves Pinto Prioli Nupélia - Universidade Estadual de Maringá

3. Marcadores Moleculares RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP DNA mitocondrial

4. RAPD SPAR Microssatélites NÃO exige conhecimento prévio do genoma Exige um conhecimento parcial do genoma NÃO exige conhecimento prévio do genoma DNA mitocondrial Marcadores Moleculares

5. Marcadores Moleculares Simples, Baixo Custo Imenso Número de Locos Mas... Dominantes Trabalhoso Alto Custo Co-Dominantes ! RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP ? Custo Haplóide; Alto No Cópias Herança Materna Não Recombina Evolução Rápida DNA mitocondrial

7. DNA – Estrutura e Replicação • A seqüência de bases codifica a • informação genética. • Com um molde e um primer a • DNA polimerase sintetiza um • novo polinucleotídeo. • A necessidadedeumprimer per- • mite a síntese invitro (PCR) de • fragmentos de interesse.

8. PCR – Reação da Polimerase em Cadeia • Taq-polimerase • dNTP • Mg2+ • Tampão • Primers • DNA • Ciclos com mudanças • de temperatura A repetição d o ciclo amplifica o o número de cópias do segmento entre os sítios do par de primers. O resultado é lido em gel.

10. Hot springs -Yellowstone National Park -USA

11. A “picture” of the bacteria

12. PCR (Polymerase Chain Reaction) • Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985. • Eficiência na detecção de polimorfismo. • Síntese enzimática de milhões de cópias na presença da DNA pol. • Reação: anelamento e extensão com um par de primers • sintetizados artificialmente. • CICLO • Desnaturação Anelamento Extensão

17. RAPD Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso • Técnica desenvolvida por Williams et al. (1990). • Primer curto e arbitrário. Não se sabe, antecipadamente, em em quais posições do genoma ocorrerão pareamentos. • A amplificação é garantida por sítios de iniciação próximos e em fitas opostas. • Cada fragmento amplificado é uma característica binária do indivíduo ou da população. • Vantagens principais: baixo custo, grande número de locos e não há necessidade de qualquer conhecimento prévio do genoma do organismo.

18. Loco RAPDé um segmento amplificável, incluindo os dois sítios de iniciação. Cada loco pode ser tratado como um sistema de DOIS ALELOS A configuração do segmento que resulta em amplificação é oALELO DOMINANTE A configuração que não amplifica é o ALELO RECESSIVO (nulo) A INFORMAÇÃO OCULTA PELA DOMINÂNCIA É PERDIDA: não há como saber se a população está em equilíbrio de HW, pois os heterozigotos não podem ser identificados.

19. Marcadores RAPD

22. Parâmetros desenvolvidos para marcadores co-dominantes podem ser estimados com RAPD, admitindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg. • Exemplos: • Distâncias genéticas • Índice de fixação FST (diferenciação genética) • Número de migrantes (Nm) • ... Para amostras pequenas, a metodologia de Lynch e Milligan (1994) miniminiza o erro introduzido pela suposição de equilíbrio.

23. Nem sempre é necessária a suposição de equilíbrio. • Índices de similaridade (Jaccard ou outro) • Coordenadas principais • Componentes principais • Componentes de variância da AMOVA • Diversidade de Shannon • . . . • Estas análises não protegem contra a perda • da informação oculta pela dominância.

24. Usar RAPD? Se para a espécie ainda não existem marcadores mais eficientes, decide-se diante da relevância e urgência. O RAPD gera estimativas menos precisas, mas é muito útil como ferramenta exploratória e em combinação com marcadores mais informativos.

28. Marcadores Moleculares Simples, Baixo Custo Imenso Número de Locos Mas... Dominantes Trabalhoso Alto Custo Co-Dominantes ! RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP ? Custo Haplóide; Alto No Cópias Herança Materna Não Recombina Evolução Rápida DNA mitocondrial

29. Marcadores Moleculares Mitocondriais • Metodologia • Escolha da Seqüência(Qual é o Objetivo?) • DNA Total • Amplificação via PCR • Clonagem do Fragmento • Seqüenciamento • Seqüência: Edição e Alinhamento

33. mtDNA • Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que • genes nucleares de cópia simples. • Alta velocidade de evolução - No Transição > Transversão • CO I, II, III e Citocromo b = Evolução + lenta (conservados) • ND, ATPases = Evolução menos lenta (~menos conservados) • tRNAs = Evolução lenta; pequenos (59-75 bp) (primers) • rRNAs = Evolução lenta (interessantes p/ espécies distantes) • D-Loop ou Região Controle= Mais variável do mtDNA.

34. FRAGMENTOS D-loop DE 450 pb de Astyanax (lambari) 600 pb

37. ELETROFEROGRAMA (EDIÇÃO NO COMPUTADOR) Picos com as cores correspondentes a cada nucleotídeo.

39. Molecular Markers and Genetic Variability of Hoplias aff. malabaricus Populations from the Floodplain of Upper Paraná River PRIOLI1,2*, Alberto J.; LUCIO1, Léia C.; MANIGLIA1, Thiago C.; PRIOLI1,2, Sônia M. A. P.; JÚLIO Jr1,2, Horácio F.; PAZZA1, Rubens; PRIOLI1,3, Laudenir M. 1Nupélia – Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura; 2Depto. Biol. Celular e Genética; 3Depto. Biologia – Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá, PR, Brazil. *Autor para correspondência (Phone: 44-261-4750; Fax: 44-263-1424; e-mail: ajprioli@nupelia.uem.br)

40. Planície de inundação do alto rio Paraná Base Nupelia-UEM em Porto Rico - PR Sete Quedas Reservatório de Itaipu Foz do Iguaçu

44. Planície de inundação do alto rio Paraná Base Nupelia-UEM em Porto Rico - PR Sete Quedas Reservatório de Itaipu Foz do Iguaçu