Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento / Marcadores Moleculares

1. BiotecnologiaAplicadaaoMelhoramento/MarcadoresMoleculares Antonio Costa de Oliveira, PhD Pelotas, 02/09/2014

2. Introdução • Genômica – é a disciplina da genética que foca no estudo de genomas de organismos. Inclui: • Sequenciamento • Mapeamento Genético • Heterose, epistasia e pleiotropia (fenômenos intragenômicos)

3. GenômicaFuncional • É o campo da biologia molecular que tenta fazer uso de uma grande quantidade de dados produzidos por projetos genômicos para descrever funções de genes e proteínas. • Foca em aspectos dinâmicos como transcrição, tradução e interações proteína-proteína. • Envolve métodos de alta escala (high-throughput)

4. Mapeamento Genético • É o posicionamento de sequências de DNA nos cromossomos • Mutantes ou variantes alélicos • Marcadores em grande escala • Utiliza frequências de recombinação

5. MapeamentoComparativo • É baseado no princípio que a ordem de genes homólogos nos cromossomos em diferentes espécies eucariotas é frequentemente conservada tanto dentro como entre familias. • Sintenia – conservação da ordem de genes sugere que os segmentos cromossômicos são originários de um grupo ancestral de ligação comum.

6. Mapeamento por desequilíbrio de ligação (LD) • Na genética de populações, LD é a associação não randômica de alelos em dois ou mais locos, que podem ou não estar no mesmo cromossomo (desequilíbrio de fase gamética ou desequilíbrio gamético). • É a ocorrência de algumas combinações alélicas ou de marcadores em uma população em uma frequência maior ou menor do que a esperada de uma formação randômica de haplótipos.

7. Genômicatraducional • Implica na adaptação da informação derivada de tecnologias genômicas para o melhoramento de culturas

8. Salentjin et al., 2007

9. Bases do mapeamento genético • Marcadores morfológicos

10. Marcadores morfológicos • Genes ou elementos regulatórios associados a uma modificação fenotípica que podem ser localizados no genoma. • São os primeiros fatores identificados por Mendel

11. Marcadores moleculares • Marcadores moleculares são fragmentos de DNA associados com uma certa localização no genoma. • Usados em biologia molecular e biotecnologia para identificar uma sequência em particular do DNA em um conjunto de sequências desconhecidas.

12. Marcadores bioquímicos • Obsoletos após a descoberta dos marcadores moleculares, eram obtidos pelo mapeamento de diferentes isoformas de enzimas (isoenzimas) ou de frações de proteínas.

13. Leis de Mendel • "lei da segregação“- características herdadas são passadas igualmente por cada um dos pais, e, em vez de se misturarem, elas se mantêm separadas. Isto é, cada uma das características é gerada por um par de instruções, com as instruções «dominantes" determinando a aparência da prole e as instruções "recessivas" mantidas latentes. (As características recessivas aparecem somente quando ambos os fatores em um par são recessivos.)

14. Leis de Mendel • "lei da variação independente" - a contribuição de cada pai com um fator é algo governado pelas leis da probabilidade - fatores dominantes não têm maior probabilidade de serem passados adiante do que os recessivos.Características herdadas também são independentes: as instruções para altura não têm nada a ver com as instruções para a cor.

15. Mendel não descreveu ligação!

16. Ligação As leis de Mendel tem uma base física. locus, ligação, ligados, sintênico Podem haver muitos genes no mesmo cromossomo.   Thomas Hunt Morgan - mosca das frutas, Drosophilamelanogaster. Fenótipo selvagem; fenótipo mutante; mutações naturais; mutações induzidas.

17. Ligação • Alelos de genes não ligados são combinados por segregação independente; • Genes ligados podem ser recombinados durante crossing-over; • Tipos paternos; tipos recombinantes; • Usar os dados de recombinação para mapear a localização de genes nos cromossomos; • Mapa de ligação, distância no mapa

18. O que é ligação? • Locus = posição de um gene no cromossomo; • Genes no mesmo cromossomo are ditos sintênicos; • Genes próximos fisicamente em um mesmo cromossomo são mais propensos a ficarem juntos durante o crossing-over, e são ditos “ligados” – eles são herdados juntos, ou co-segregam; • Genes mais afastados em um cromossomo são mais propensos a sofrer recombinação durante o crossing-over. Se estiverem longe o suficiente, irão mostrar segregação independente; • O fenômeno da recombinação foi primeiramente descrito por Thomas Hunt Morgan para a mosca das frutas em 1912 na Universidade de Columbia.

21. Figure 15.0 Chromosomes

22. Gen A, alelo 1 ...AATAAGCGCTTT... ...TTATTCGCGAAA... ...AATAACCGCTTT... ...TTATTGGCGAAA... Gen A, alelo 2

23. Gene B Gene A

24. Figure 15.1 The chromosomal basis of Mendel’s laws

25. Drosophila melanogaster Meigen “wild-type” female ebony or black body, vestigial winged male

26. Outra maneira de nomear alelos: O nome do Gene em itálico sobrescrito com um + para o tipo “selvagem” – o alelo comumente visto na natureza. Assim, para o locus da asa vestigial da Drosophila melanogaster, os dois alelos comuns são: vg+ - dominante, asas normais (selvagem). vg - recessivo, asas curtas ou não funcionais.

27. Evidência para genes ligados em Drosophila

28. Drosophila testcross

29. Recombinação quebra a ligação O Crossing- over durante a prófase I da meiose resulta na produção de mais tipos de gametas do que seria previsto pelas leis de Mendel somente.

31. O aluno de Morgan, Alfred Sturtevant, usou o test cross design para mapear a posição relativa de três genes da mosca das frutas afetando cor de corpo (black, b), tamanho de asa (vestigial, vg), e cor de olho (cinnabar, cn). • A frequência de recombinação entre cn e b é 9%. • A frequência de recombinação entre cn e vg é 9.5%. • A frequência de recombinação entre b e vg é 17%. • O único arranjo possível destes 3 genes coloca o gene da cor de olho entre os outros dois.

32. As 3 frequências de recombinação no nosso exemplo de mapeamento não são completeamente aditivas: 9% (b-cn) + 9.5% (cn-vg) > 17% (b-vg). • Isto resulta de múltiplos eventos de crossing-over. • Um segundo crossing-over “anula” o primeiro e reduz o número de progênies recombinantes. • Os genes mais distantes (por exemplo, b-vg) são mais propensos a sofrerem múltiplos eventos de crossing-over. cn+ vg+ b+ b+ cn + vg+ vg cn b b cn vg Se forem considerado somente os genes b e vg, os gametas produzidos são todos b+vg+ ou bvg, mesmo que tenha ocorrido crossing-over entre eles.

33. Um mapa genético parcial de um cromossomo de Drosophila

34. Alguns pontos importantes sobre recombinação • Mapas de cromossomos preparados pela contagem do número de recombinantes são chamados de mapas genéticos; • Este método não pode distinguir entre genes muito distantes no mesmo cromossomo vs. genes em cromossomos diferentes; • % recombinantes = n. unidades de mapeamento = n. de centiMorgans (cM) separando dois genes; • Múltiplos cross-overs resultam na subestimação do % de recombinantes, especialmente para genes que estão muito afastados no cromossomo; • Probabilidade de um cross-over ou frequência de recombinação não é uniforme no comprimento do cromossomo, e.g. pequena para centrômeros; • Mapas Citológicos de cromossomos são feitos com base em padrões de coloração (como os cromossomos são vistos no microscópio) • Mapas físicos de cromossomos são feitos pela clonagem de fragmentos de DNA em bactéria e arranjando–os em ordem no cromossomo. Proetos determinam a sequência de bases nucleotídicas no cromossomo, um mapa de sequência; • 1 cM = aproximadamente 1 megabase (106 bp DNA) em humanos, mas esta equivalência difere entre organismos, e.g., em abelhas 1 cM = é apenas 50 kilobases

35. A ervilha tem sete cromossomosDois não tem nenhum dos sete genes de Mendel, três dos genes de Mendel estão em cromossomos separados e dois cromossomos tem dois genes cada. Em ambos os casos os genes estão distantes o suficiente que o crossing over foi tão frequente que ele interpretou a sua herança como segregação independente; Mendel teve sorte ou ignorou qualquer evidência de ligação. Nós gostamos de pensar que ele teve sorte.