Ordre de passage pour les présentations

1. Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

2. Techniques d’étude des interactions protéine-protéine à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1002 – hiver 2013

3. Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ? • beaucoup de matériel à disposition • focus sur l’étude des fonctions cellulaires • capacité des protéines à former des complexes • ≈5 partenaires pour chaque protéine • importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel  interactome

4. De nombreuses techniques d’étude Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 • in vivo • maintien du contexte cellulaire • in vitro • caractérisation détaillée des interactions • (cinétique, stochiométrie …) • validation des résultats in vivo

5. Co-immunoprécipitation http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F

6. Double hybride Principe : • utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure • domaine d’activation • domaine de liaison à l’ADN • fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription • expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

7. DA prot 3 prot 2 prot 1 DL DL mARN Double hybride Système rapporteur DA : domaine d’activation DL : domaine de liaison à l’ADN DA TF DL colonies de levures pas d’expression expression du gène mARN Fusion protéines et modules du facteur de transcription Expression du système

8. Double hybride Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246. Avantages : • expérience facile à mettre en place Inconvénients : • analyse qualitative • faux positifs si les interactions préexistent chez la levure • faux négatifs : problème d’expression des protéines cibles chez la levure • non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) Application : • identification des interactions • criblage de banque de protéines

9. Interactome chez Caenorhabditis elegans Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

10. PCA : protein fragment complementation assay Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344 Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Principe : • rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) • fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester • mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent

11. PCA : protein fragment complementation assay Avantages : • applicable pour les protéines membranaires • réponse très rapide • niveau d’expression naturel Inconvénients : • décalage temporel de la réponse au signal d’expression • création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions • nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Application : • identification des interactions • étude des réseaux d’interaction

12. R0 10-70 Å excitation émission accepteur 525 nm 475 nm nm 475 FRET (fluorescence resonance energy transfer) L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846 donneur 525 Principe : • excitation d’un fluorophore donneur par un photon • émission fluorescence par le donneur • excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche • mesure du rapport de fluorescence

13. FRET (fluorescence resonance energy transfer) Avantages : • étude dynamique en temps réel • applicable in vivo dans le système cellulaire originel • peut être couplé à un signal biologique • applicable dans tous les compartiments cellulaires Inconvénients : • création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions • nécessite la surexpression des protéines testées Application : • signification biologique des interactions • localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie

14. TAP-Tag : Tandem Affinity Purification tag Principe : 1. peptide de fixation à la calmoduline domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase 2. • constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules • fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants • clivage du tag par la protéase • fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase • élution du complexe et analyses subséquentes 3. 4. 5. Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229

15. Spectrométrie de masse Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21 Inconvénients : • nécessite la purification des complexes • méthode compliquée et relativement coûteuse Application : • identification des protéines présentes dans un complexe

16. TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Avantages : • seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe • taux d’expression biologique des protéines • identification de complexes avec plus de 2 protéines Inconvénients : • seules les interactions très stables peuvent être détectées • nombreux faux positifs (protéines « colle ») Application : • identification des complexes protéiques

17. Quelques définitions Arbre = réseau connexe non cyclique noeud branche Réseau connexe non cyclique Réseau connexe cyclique Réseau non connexe non cyclique

18. Jeong et al, Nature 2001

19. Qualité du réseau d’interactions Très nombreuses interactions protéine/protéine détectées par différentes méthodes • Pourquoi ? • Les méthodes sont prévues pour détecter des interactions différentes (binaire pour le double hybride, interactions fortes pour la protéomique, etc.) • Les méthodes se trompent (faux positifs, faux négatifs) Nécessité de valider les résultats

20. Qualité du réseau d’interactions Construction d’un ensemble d’interactions validées manuellement 10 907 interactions impliquant 1308 protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae (http://mips.gsf.de/proj/yeast/catalogues/complexes/index.html) • Coverage (couverture) : fraction des interactions de référence analysées par une méthode donnée • Accuracy (précision) : fraction des interactions de référence retrouvées par une méthode donnée Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

21. Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

22. Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

23. Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

24. Qualité du réseau d’interactions Filtrage : interactions détectées trois fois pour le double-hybride, par exemple Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403

25. http://string.embl.de/ Von Mering et al. (2005) Nucleic Acids Research, 33:D433–D437

26. Distance et Distance caractéristique d’un réseau • la distanced(u,v) est la longueur du plus court chemin connectant deux noeuds, c-à-d le nombre minimal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v • la distance caractéristiqueL = meanu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur moyenne du plus court chemin connectant deux noeuds http://mathworld.wolfram.com/GraphDistance.html

27. Diamètre d’un réseau 3 4 5 7 • le diamètreD = maxu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur du plus long des plus courts chemins connectant deux noeuds, c’est-à-dire le nombre maximal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v lorsque les retours, détours et boucles sont interdits http://mathworld.wolfram.com/GraphDiameter.html

28. Réseaux « Small-World » • dans un réseau Small-World, la plupart des noeuds sont voisins les uns des autres, c-à-d qu’il faut traverser un petit nombre de noeuds pour se rendre d’un noeud u à un noeud vex : WWW ; liens sociaux entre les êtres humains formellement, on dit que son diamètre est petit (D ≤ 6) • ces réseaux ont des distances caractéristiques faibles http://en.wikipedia.org/wiki/Small-world_network

29. Connectivité d’un réseau • la connectivité K d’un réseau est le nombre minimal de liens connectant deux noeuds u et v • formellement, c’est le nombre minimal de noeuds qu’il faut supprimer pour déconnecter le réseau http://web.hamline.edu/~lcopes/SciMathMN/concepts/cevcon.html

30. la connectivité K d’un noeud (protéine i) est le nombre de liens émanant du noeud i Connectivité d’un noeud Exponential Scale-free HUB Jeong et al, Nature 2000

31. Une autre représentation du réseau 6 3 7 4 8 2 5 1 9

32. Après un algorithme de clustering 6 3 7 4 8 2 5 1 9

33. Modular organization of cellular networks D 0 1 P - polarity R - Ras related pathway H - Highly osmotic conditions M - Mating/filamentation Rives AW et al. PNAS, 2003

34. Modular organization of cellular networks - Modules - Intermodular connections Rives AW et al. PNAS, 2003

35. Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

36. Recherche de modules A(i,j) : indice de socio-affinité ni;j|i=bait : nombre of fois où protéines i et j sont retrouvées quand I est étiquettée : nombre of proies récupérées quand i est un appât : nombre de fois où protéines i and j sont copurifiées avec d’autres appâts. Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

37. Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

38. Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532

39. Essentialité des gènes Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231

40. Essentialité des gènes Hubs : 1061 protéines qui ont le plus grand nombre d’interactions Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231

41. Robustesse du réseau aux mutations Jeong et al, Nature 2000

42. Robustesse du réseau aux mutations Freeland et al. (2000) Mol. Biol. Evol. 17:511–518

43. Perspectives : combiner les réseaux Kelley & Iteker (2005) Nature Biotechnology23:561-566