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Plasmid

Plasmid. Plasmid vector?. Plasmid.

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Presentation Transcript

  1. Plasmid Plasmid vector?

  2. Plasmid # 플라즈미드(plasmid)? plasmid 란 대부분의 박테리아와 몇몇 진핵세포에서 발견되는 자기 복제 기능을 갖는 이중 고리형 DNA이며, Chromosomal DNA와는 별도로 세포내에 존재한다. Chromosomal DNA 와 비교해서 1/10도 안되는 크기로,1kb-1000kb까지 다양하며, 하나의 세포 내에 존재하는 plasmid의 수는 몇 개에서부터 수백개에 이른다. plasmid에는 항생제 저항물질을 비롯한 몇 개의 유전자가 암호화되어 다음 세대로 전해진다.

  3. Vector? # 벡터(vector)? - 유전자를 운반해 줄 수 있는 모든 운반체를 일컫는 용어다. - 벡터는 DNA 재조합 실험에서 targetDNA 단편을 숙주(Host)에 도입 (transfection) 시켜 증식하도록 하는 클로닝 운반체(cloning vehicle)다. - 플라스미드 클로닝 방법은 플라스미드 벡터(vector)를 제한효소로 절단하여 targetDNA 단편을 삽입한 후 숙주에 도입시킨다. 숙주에들어간 플라즈미드는 숙주가 증식됨에 따라 복제하여 targetDNA를 증식시킬 수 있다. - 1970년대 중반 이후 여러 벡터가 개발되었는데, 시판되는 벡터 대부분이 플라즈미드와파아지벡터다.

  4. Plasmid가 vector로서 기능하기 위한 조건 1. 삽입된 유전자(target gene)를 증폭하기 위해서 competent cell(E.coli)안에서 복제가 가능해야 한다. 그러기 위해서는 origin of replication 이 필요하다. 2. plasmid가 들어간 세포만을 골라낼 수 있어야 하니까 selection marker가 필요하다. 즉 Ampicillin, kanamycin, Chloramphenicol 등과 같은 항생제에 내성을 지니는 유전자를 포함하고 있어야 한다. 항생제가 있는 조건에서 세포를 키우면, 원하는 plasmid를 가지고 있는 세포만이 살고, 그렇지 않은 세포는 죽기 때문이다. 3. 삽입된 유전자가 단백질로 발현시키는 것이 목적이라면, promoter가 있어야 한다. 주로 많이 사용되는 것이 SV40, CMV promoter다. 4. multicloning site가 있어야 한다. vector 안에 유전자를 넣었다 뺐다 할 때 제한효소 (restriction enzyme)를 사용해서 잘라내고 다시 붙일 수 있는 자리가 필요하다. 이런 제한효소 자리가 몰려 있는 부분이 multicloning site다. 판매되는 vector들은 위에 조건에 맞추어 효율을 최적화 시켜 놓은 것이다.

  5. 대표적인 Plasmid vector 판매 회사 1. Promega(http://www.promega.com/ ): T-vector 2. Invitrogen(http://www.invitrogen.com/): pcDNA vector 계열 3. Clontech(http://www.clontech.com/): pEGFP-C1vector 계열 4. Novagen(http://www.gelifesciences.com/): pET vector 계열 5. GE Healthcare(http://www.gelifesciences.com/): pGEX vector 계열

  6. Plasmid DNA 분리법 Ⅰ 1.Column chromatography 용균액을 column에 통과시키면 선택적인 흡착력에 의해서 각 성분들은 다른 속도로 내려가게 되는데 약하게 흡착된 물질이 강하게 흡착된 물질보다 더 빠르게 전개되는 원리를 이용한다. 2. EtBr_CsCl 밀도구배 원심법 CsCl density gradient centrifugation에서, 고속(40,000 rpm)의 원심분리 안(48hr) 원심력은 Cs과 Cl ion을 튜브(tube)의 바닥쪽으로 당기기 때문에 농도구배가 형성되어 CsCl 밀도는 바닥쪽으로 갈수록 더 커진다. 고분자와 함께 원심분리되면 분자의 고유한 밀도와 동일한 CsCl밀도 위치에 밴드(band)를 형성하게 되며 DNA는 1.7g/㎤, 단백질은 상단부, 그리고 RNA는 바닥에 pellet을 형성하게 된다. 3. Boiling lysis method 이것은 alkaline lysis 방법과 유사한데, DNA 2중가닥을 한 가닥으로 만들기 위한 방법으로 높은 온도의 열을 사용하는 것이다. 이 기술은 alkaline lysis보다 오래되었지만 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어져자주 쓰이지는 않는다.

  7. Plasmid DNA 분리법 Ⅱ 4. alkaline lysis method Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 파괴하는데 이때,SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다. 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 plasmid는 supercoild 형태이기 때문에 갑작스런 중성화에도 빠르게 본래 형태를 갖추지만 chromosomal DNA는 긴 double-helix형태 때문에 서로 엉켜서 bacterial proteins와 함께 대부분 침전된다. plasmid DNA는 상등액에 분리되는 원리다.

  8. Miniprep이란? Plasmid preparation의 한 방법으로 배양액 양과 수득율에 따라 miniprep(A typical plasmid DNA yield of a miniprep is 20 to 30µg depending on the cell strain), midiprep(The starting E. coli culture volume is 15-25 ml of LB broth and the expected DNA yield is 100-350µg), maxiprep(The starting E. coli culture volume is 100-200 ml of LB broth and the expected DNA yield is 500-850µg) , megaprep(The starting E. coli culture volume is 500 ml – 2.5 L of LB broth and the expected DNA yield is 1.5-2.5 mg) 그리고gigaprep(The starting E. coli culture volume is 2.5-5 L of LB broth and the expected DNA yield is 7.5–10 mg)등으로 kit화 되어 판매된다. kit(Qiagen제품이 가장 퀄리티 높음)의 종류 뿐 아니라수득율은 plasmid copy number, type, size, bacterial strain, growth conditions에 따라 차이가 있다.

  9. 실험: 플라즈미드 DNA의 분리(Mini-prep kit) • (1) 재료 및 장비 • - 항생제(Ampicilin) LB 액체배지에 키운 3-5ml DH5α (pcDNA 6B plasmid 형질전환체)박테리아 배양액 Ⅰ • - 항생제(Ampicilin) LB 액체배지에 키운 3-5ml DH5α (pcDNA 6B EGFP-EcR plasmid 형질전환체) 박테리아 배양액 Ⅱ • 탁상용1.5ml 튜브용 원심분리기 • -20℃ freezer • - ExprepTM plasmid SV • - 비커(waste 용도) • - 블루 파이펫 (1000μL), 블루 tip, 옐로우 파이펫(100μL), 옐로우 tip • 멸균된 1.5ml 튜브와 랙 • Namepen • 폴리글로브 • 타이머

  10. (2) 실험방법 세포배양액 준비 ① 항생제 첨가 3-5ml LB배지에 세포를 접종한 후 37℃에서 16시간 이상 배양한다. ② 배양된 세포를 멸균된 1.5ml 튜브에 옮겨 담고 12000xg에서 1분간 원심 분리한 후 상층액을 털어낸다.

  11. 세포 용해 ③ Buffer SⅠ을 250μL 넣고 강하게 흔들어 재부유시킨다(resuspending). ④ 이어서 Buffer S2를 250μL 넣고 상하로 4번 흔들어준다(inverting). Notice! 절대 votex 하지 말 것! 반응물이 투명해질 때까지 반응시킨다. 단, 5분은 넘지 않는다. ⑤ Buffer S3를 350μL 넣은 즉시 빠르게 상하로 4-6번 흔들어준다(inverting). ⑥ 10분간 원심 분리한다.

  12. 플라즈미드 분리(Isolation) 및 정제(Purification) ⑦ 분리된 액을 침전물이 딸려오지 않도록 조심스럽게 spin column에 옮기고 30초간 원심 분리 후 collection tube를 비운다. ⑧ (Option) 500μL Buffer AW를 spin column에 옮기고 30초간 원심 분리 후 collection tube를 비운다. ⑨ Buffer PW를 700μL 넣고 30초간 원심 분리 후 collection tube를 비운다. ⑩ 빈(empty) column 을 1-2분간 원심 분리 후 새로운 1.5ml 튜브에 끼운다. ⑪ Buffer EB 50μL를 넣고 1분간 방치(standing)한 후 1분간 원심 분리한다. ⑫ 다음 실험까지 -20℃ freezer에 보관한다.

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