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快速扩增 cDNA 末端 ——RACE

快速扩增 cDNA 末端 ——RACE. RACE 的基本概念 不同厂家 RACE 试剂盒的介绍 RACE 技术的关键环节 存在的问题及解决办法. RACE 的基本概念. cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends, RACE) 技术是基于 PCR 技术由已知的部分 cDNA 序列来获得完整 cDNA 序列的一种方法，为 Frohman 在 1985 年首次报道。 3’RACE 和 5’RACE. 3’RACE 原理示意图. mRNA. (A)n. (A)n. 5’. 5’. 3’. GSP. 5’.

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快速扩增 cDNA 末端 ——RACE

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Presentation Transcript

  1. 快速扩增cDNA末端——RACE

  2. RACE的基本概念 • 不同厂家RACE试剂盒的介绍 • RACE技术的关键环节 • 存在的问题及解决办法

  3. RACE的基本概念 • cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。 • 3’RACE 和5’RACE

  4. 3’RACE原理示意图

  5. mRNA (A)n (A)n 5’ 5’ 3’ GSP 5’ AAP AUAP 5’ 5’ GI … IG GI … IG 3’ AUAP 3’ CC…CC 5’ GSP2 nested GSP 3’ 5’ nested GSP 5'RACE原理示意图 5’ 3’ 3’CC…CC

  6. 不同厂家RACE试剂盒的介绍 • Invitrogen GeneRacerTM Kit • BD SMARTTM RACE

  7. RACE技术的关键环节 • RACE 技术的关键环节有2个： 1. 3个连续的酶促反应 （逆转录、TdT加尾、PCR扩增） TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端 2. RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。

  8. 存在的问题及解决办法 • 反转录 • RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 • 反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。

  9. 提供一种改进的反转录方法 • 在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分： • Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。 • 在混合物中，依次加入以下成份： • 10X SSⅡ（ SSⅢ）Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入2号管中。 • 每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ（SSⅢ），轻轻混匀，50℃反应50min。 • 70℃放置15min以终止反应。 • -20℃保存。

  10. TdT加尾反应及其替代反应 • 首先在反转录后，一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功，降低目的cDNA加尾的有效性，从而导致第二链cDNA合成效率的降低。 • 其次，TdT反应难以控制，所有的cDNA都被加尾，而不管是否是全长cDNA，这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应，而且会优先扩增，不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。

  11. TdT加尾反应及其替代反应 • 第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。 • 我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。 • RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终均获得了完整的5’末端。

  12. RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验： • 引物不能设计在保守区简并引物区。 • 各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。 • 尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正确性。

  13. PCR扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题 • 一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物； • 另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法： • 热启动PCR(hotstartPCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touch－down PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。 • 利用抑制PCR(suppression PCR)技术改进RACE程序，可大大减少非特异性的线性化扩增。 • 单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照，并减少引物的浓度。

  14. M 1 2 3 M 4 5 M 6 7 8 9 M：2000marker； 1：5GSP11+NAP； 2：NAP； 3：GSP 11； 4：5GSP22+AUAP； 5,7,9：AUAP； 6,8：5GSP44+ AUAP 图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified

  15. M 1 2 M 5 6 M 3 4 C A B A：The first PCR； BC：Nest PCR M：2000marker； 1：5GSP11+NAP； 2：NAP； 3：5GSP332+AUAP； 4,6：AUAP； 5：5GSP333+AUAP 图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified

  16. M 1 2 3 4 5 6 M M：2000marker； 1：3GSP441+AUAP； 3：3552+AUAP； 5：3IPCR2+AUAP 2,4,6：AUAP； 图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified

  17. 图5’RACE、3’RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果图5’RACE、3’RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果 Fig. The contig result of 5’RACE 、3’RACE and GsAP2 by software

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