Hierro-Sodio- cido sc rbico

1. Hierro-Sodio-�cido �sc�rbico M�todo Absorci�n At�mica Fe y Na Valoraci�n oxidim�trica Vit C

2. Validaci�n de un m�todo anal�tico. Una vez desarrollado un m�todo anal�tico, al igual que toda t�cnica anal�tica deber� validarse, es decir, se debe confirmar y documentar que los resultados producidos por el m�todo son confiables. En general, para validar existen 3 tipos de validaci�n: -Validaci�n Prospectiva: es aquella validaci�n realizada a m�todos anal�ticos nuevos. -Validaci�n Retrospectiva: Para m�todos anal�ticos antiguos, pero que se usan en forma rutinaria, y que no han sido validados. -Revalidaci�n: repetici�n parcial o total de una validaci�n debido a cambios efectuados, que puedan afectar a la capacidad del m�todo validado. (1) La validaci�n se puede realizar mediante estudios intralaboratorio o interlaboratorios. -Estudios Intralaboratorio: este tipo de validaci�n lo realiza un laboratorio individualmente, utilizando materiales de referencia, comparaci�n con otro m�todo, utilizando muestras blanco o muestras positivas fortificadas, etc. -Estudios interlaboratorios: conjunto de mediciones a un nivel o varios niveles de concentraci�n del analito problema, ejecutadas independientemente, por varios laboratorios, sobre muestras de un material dado. (11)

3. Validaci�n Al momento de validar un m�todo anal�tico se requiere actuar mediante procedimientos correctos entre los que se incluyen; una buena organizaci�n funcional; personal adecuadamente adiestrado en la aplicaci�n del m�todo; instalaciones adecuadas y suficientes; equipos, reactivos y material de laboratorio apropiado y en perfectas condiciones para su uso; m�todos escritos, actualizados y aprobados. De esta forma se puede garantizar la calidad de los resultados obtenidos en el laboratorio.

4. Par�metros Fundamentales de Validaci�n. Una vez que se ha realizado el ajuste de los par�metros y se ha probado con �xito el m�todo en muestras, se est� en condiciones de realizar la validaci�n del m�todo, para poder confirmar y documentar que los resultados obtenidos por el m�todo son seguros y confiables En el proceso de validaci�n, los par�metros que generalmente son evaluados son: -Selectividad -Linealidad -Precisi�n -Exactitud -Sensibilidad

5. Validaci�n Selectividad (?) La selectividad de un sistema depende de la interacci�n de todos los componentes, Longitud de onda, interferentes, etc y muestra.

6. Selectividad o especificidad. La selectividad o especificidad de un m�todo anal�tico se refiere a la capacidad de un m�todo de producir una se�al medible debida s�lo a la presencia del analito, libre de interferencias de otros componentes en la matriz de muestra, estas interferencias pueden ser productos de degradaci�n, metabolitos del mismo analito en un fluido biol�gico, etc. La selectividad se puede controlar simplemente por la adici�n, por ejemplo del doble de est�ndar puro, verificando el aumento de su se�al.

7. Linealidad. La linealidad de un m�todo anal�tico se refiere a la capacidad de un m�todo de obtener resultados linealmente proporcionales entre la concentraci�n de analito y su respuesta. Este par�metro se considera como un criterio inicial de validaci�n, y es necesario verificarlo si se va a trabajar con un s�lo est�ndar en las determinaciones de rutina. Al trabajar con est�ndares m�ltiples se puede aceptar m�todos no lineales,. Junto con establecer la linealidad del m�todo se puede estimar el rango de linealidad del m�todo, es decir, el intervalo de concentraciones para el cual el m�todo ha demostrado responder en forma lineal y dentro del cual se puede estimar la cantidad de analito por interpolaci�n. Para determinar la linealidad se prepara una serie de, al menos, cinco diluciones de un est�ndar, las cuales deben estar de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra. Se efect�a el an�lisis siguiendo exactamente el procedimiento descrito. En procedimientos cromatogr�ficos se recomienda efectuar las inyecciones por triplicado, a no ser que se use un patr�n interno.. Para Absorci�n at�mica a lo menos el promedio de 3 lecturas por concentraci�n.

8. El coeficiente de correlaci�n(r) a) Coeficiente de correlaci�n (r). El coeficiente de correlaci�n refleja el grado de relaci�n o ligaz�n entre las variables x (concentraci�n), y (respuesta). El valor r = 1 indica una recta perfectamente lineal de pendiente positiva, r = -1 una recta perfectamente lineal de pendiente negativa y r =0 la no correlaci�n entre x e y. En an�lisis qu�mico se obtienen valores de r elevadas, iguales o superiores a 0,999, si bien en an�lisis de trazas se aceptan valores mas bajos (iguales o superiores a 0,99). Sin embargo, el mejor indicador del modelo lineal no es r sino un test estad�stico, en el cual se calcula un valor tr (n-2 grados de libertad y se compara con el valor de t tabulado para el nivel de confianza requerido. En este caso si tr es mayor que el t de tabla, significa que existe una correlaci�n lineal entre x e y, para el nivel de confianza requerido. tr = ?r? ?(n-2)__ ?(1-r2) Donde: r = coeficiente de correlaci�n n = numero de mediciones

9. Curva de calibraci�n que relaciona respuesta �rea, alturas, absorbancia, etc., con concentraci�n o cantidad de analito. La cual posteriormente se gr�fica para su documentaci�n e interpretaci�n estad�stica. La recta de calibraci�n es del tipo: y = bx + a Donde: x = corresponde a la concentraci�n y = corresponde a la respuesta b = el valor de la pendiente o variaci�n de respuesta por unidad de concentraci�n. a = el termino independiente o intercepto sobre el eje Y. Interpretaci�n estad�stica de la regresi�n lineal. La representaci�n gr�fica suele ser suficiente. Sin embargo conviene efectuar una interpretaci�n estad�stica de la regresi�n lineal.

10. b) Significaci�n estad�stica de la varianza de la pendiente b La pendiente b se llama tambi�n coeficiente de regresi�n, y se determina como par�metro indicativo de la sensibilidad, el cual a mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del m�todo frente a los cambios de concentraci�n del analito). La varianza de la pendiente Sb2 se utiliza como expresi�n matem�tica de la linealidad, a menor varianza mejor linealidad, para expresar la linealidad tambi�n se utiliza la desviaci�n est�ndar de la pendiente Sb y el coeficiente de variaci�n (%CV) A su vez los limites de confianza de la pendiente se hallan a partir de la expresi�n: b + t Sb Donde: b = valor de la pendiente t = valor de la distribuci�n de Student para n-2 grados de libertad para el grado de confianza escogido. Sb = desviaci�n est�ndar de la pendiente.

11. c) Significaci�n estad�stica de la varianza de la ordenada al origen El valor de a ( ordenada al origen), se determina para verificar si la recta pasa por el origen y que cualquier desviaci�n puede adjudicarse �nicamente a valores aleatorios, por lo que en un caso ideal debe ser cero. Al igual que en el caso de la pendiente para poder obtener los intervalos de confianza de la ordenada al origen se calcula en funci�n de su varianza Sa2, su desviaci�n est�ndar Sa. Y estos se hallan a trav�s de la formula: a+ t Sa Donde: a = valor de la ordenada al origen. t = valor de la distribuci�n de student para n-2 grados de libertad para el grado de confianza escogido. Sa = desviaci�n est�ndar de a

12. Precisi�n  La precisi�n es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos anal�ticos efectuados sobre una muestra homog�nea o, expresado de otra forma, la dispersi�n de los valores anal�ticos alrededor de su media. La precisi�n indica la capacidad del m�todo para dar resultados semejantes cuando se aplica repetidamente a una muestra. La precisi�n se expresa matem�ticamente por la media para el valor central y la desviaci�n est�ndar para la dispersi�n de los resultados, y m�s com�nmente por la desviaci�n est�ndar relativa (RSD). La precisi�n requiere del an�lisis sobre una muestra y la precisi�n as� obtenida se denomina del m�todo, puesto que incluye todo el procedimiento anal�tico, desde la preparaci�n de la muestra hasta la lectura instrumental. Tambi�n se puede determinar directamente la precisi�n del sistema, hallando la variabilidad de respuesta de una soluci�n patr�n. Por lo que la precisi�n se distinguir� en 2 tipos de estudios:

13. Precisi�n -Precisi�n del sistema: la cual eval�a la dispersi�n de al menos 6 inyecciones del est�ndar o repeticiones de lecturas de absorbancias. -Precisi�n del m�todo: evaluando la dispersi�n de varias preparaciones de la muestra final homog�nea A su vez la precisi�n deber� medirse en condiciones repetitivas, es decir, mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, el mismo d�a y con los mismos aparatos y reactivos. Tambi�n debe medirse en condiciones reproducibles, es decir, medir la precisi�n de un m�todo, efectuado sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes, analistas, aparatos, d�as, etc. El cociente repetibilidad/reproducibilidad, es de gran utilidad para evaluar la precisi�n de un m�todo anal�tico. Su valor seg�n estudios realizados por la AOAC es normalmente comprendido entre 1,5 y 2. Valores mayores a 2 son indicadores de un m�todo muy personal y valores inferiores a 1,5 indican pobre repetibilidad.

14. Precisi�n Los criterios de aceptaci�n pueden ser variables, por ejemplo la USP indica una RSD del sistema de no m�s de 2%, inyectando 5 veces una soluci�n est�ndar. Existen tablas que relacionan la RSD m�xima aceptable para un m�todo anal�tico en funci�n de los l�mites de aceptaci�n y del n�mero de r�plicas. En muchos casos debe indicarse el intervalo de confianza de la medida, es decir el rango en el cual se encuentra presente el analito, preferentemente, cuando el numero de muestras es peque�o (menor de 30), las medidas independientes, y la distribuci�n normal, puede calcularse de acuerdo a la distribuci�n de Student seg�n la formula: X - t?,? x S < ? < X + t?,? x S ?n ?n Donde: X = promedio de las mediciones t?,? = es el valor de Student, tabulado para n mediciones con ?= n-1 grados de libertad y para el nivel ? de confianza empleado, generalmente 95%. S = desviaci�n est�ndar de las mediciones n = numero de mediciones.

15. Sensibilidad La sensibilidad de un m�todo anal�tico se relaciona con la cantidad m�nima de analito requerida para dar un resultado significativo, cualitativo o cuantitativo. Debe distinguirse entre sensibilidad de calibrado y sensibilidad anal�tica. a) Sensibilidad de calibrado: corresponde a la pendiente de la recta de calibraci�n, es decir, la se�al o respuesta por unidad de concentraci�n. b) Sensibilidad anal�tica: corresponde a la sensibilidad de calibrado dividida por la desviaci�n est�ndar de la respuesta. Los par�metros a definir para poder evaluar la sensibilidad de un m�todo anal�tico son los limites de detecci�n y de cuantificaci�n.

16. Los pasos a seguir son los siguientes: a) Se determina la pendiente de la curva de calibraci�n (concentraci�n v/s respuesta) en el rango apropiado: b) Se realiza otra curva de calibraci�n, inyectando cada punto por triplicado, pero en este caso para concentraciones menores de analito, determin�ndose la ecuaci�n de esta nueva recta de calibraci�n y se extrapola la respuesta a concentraci�n cero, obteni�ndose un estimado de la respuesta del blanco: Ybl c) Se determina la desviaci�n est�ndar correspondiente a cada concentraci�n del punto 2, se calcula la recta correspondiente a concentraci�n v/s s y se extrapola como en el caso anterior la desviaci�n est�ndar a concentraci�n cero, obteni�ndose el estimado correspondiente a la desviaci�n est�ndar del blanco: Sbl

17. a) Limite de detecci�n: corresponde seg�n la USP XXII, a la menor concentraci�n de analito en una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones experimentales establecidas y se expresa en unidades de concentraci�n (%, ppm, ppb, etc.). Se calcula como: Limite de detecci�n = Ybl + 3 Sbl_ b Donde: Ybl = valor estimado de la respuesta del blanco. Sbl = desviaci�n est�ndar estimada del blanco b = pendiente de la curva de calibraci�n.

18. b) Limite de cuantificaci�n: seg�n USP XXII, la menor concentraci�n de analito de una muestra que puede ser cuantificada con precisi�n y exactitud aceptable bajo las condiciones experimentales establecidas y se expresa tambi�n en unidades de concentraci�n. Se calcula seg�n: Limite de cuantificaci�n: = Ybl + 10 Sbl_ b Donde: Ybl = valor estimado de la respuesta del blanco. Sbl = desviaci�n est�ndar estimada del blanco b = pendiente de la curva de calibraci�n. Los l�mites de detecci�n y cuantificaci�n se estiman a partir de la curva de regresi�n o calibraci�n, siempre que se hayan considerado concentraciones bajas de analito, por extrapolaci�n a concentraci�n cero.

19. Exactitud. La exactitud de un m�todo, tambi�n conocida como error sistem�tico o tendencia, corresponde a la capacidad del m�todo anal�tico para dar resultados lo m�s pr�ximos posibles al valor verdadero. La exactitud o bien podr�amos llamarla inexactitud, debe ser tan peque�a como sea posible, para que el valor promedio se aproxime al de referencia, es decir, la recuperaci�n del analito debe acercarse al 100%. No deben confundirse exactitud y precisi�n. La precisi�n est� relacionada con la dispersi�n de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicaci�n de lo cerca que est�n del valor verdadero. Se pueden tener mediciones muy precisas pero poco exactas.

20. Exactitud. Matem�ticamente la exactitud se expresa en forma de porcentaje de recuperaci�n de la cantidad de analito presente en la muestra, o bien en forma de diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero. Si bien el valor verdadero de concentraci�n no se conoce sino que solo puede estimarse, es posible preparar una muestra por un procedimiento m�s exacto, y utilizarla como referencia. Recuperaci�n: R= ?X_ x 100 X Donde: ? X = valor verdadero X = promedio de las mediciones

21. Exactitud En el an�lisis de trazas (micro componentes), no siempre se alcanzan recuperaciones tan elevadas y se consideran valores habituales de recuperaci�n entre el 60 y 80%. Para determinar si el valor medio hallado y el valor considerado verdadero no difieren significativamente, para esto se efect�a un test estad�stico, como lo es el test de Student, para un nivel de confianza determinado. El test de Student emplea, al menos, 3 concentraciones del analito, preparadas por triplicado, comprendidas dentro del rango de linealidad del sistema, en general se utilizan concentraciones correspondientes al 80, 100 y 120% del valor esperado.

22. Exactitud. En este caso, el valor de t se calcula como: texp = (100-R)_ RSD x ?n Donde: R = recuperaci�n porcentual. RSD = desviaci�n est�ndar relativa de las mediciones n = n�mero de repeticiones Los valores de texp se comparan con los tabulados para el intervalo de confianza requerido con n-1 grados de libertad, y la exactitud se eval�a para el promedio de recuperaci�n de todas las concentraciones. Si texp < ttabla, no existe diferencia significativa con el 100% de recuperaci�n y la exactitud es apropiada. (1)

24. Exactitud

25. Sodio M�todo Espectrofotometr�a de Absorci�n at�mica

26. Papel biol�gico El cati�n sodio (Na+) tiene un papel fundamental en el metabolismo celular, por ejemplo, en la transmisi�n del impulso nervioso (mediante el mecanismo de bomba de sodio-potasio). Mantiene el volumen y la osmolaridad. Participa, adem�s del impulso nervioso, en la contracci�n muscular, el equilibrio �cido-base y la absorci�n de nutrientes por las c�lulas. La concentraci�n plasm�tica de sodio es en condiciones normales de 135 - 145 mmol/l. El aumento de sodio en la sangre se conoce como hipernatremia y su disminuci�n hiponatremia

27. Compuestos Los compuestos de sodio de mayor importancia industrial son: Sal com�n (NaCl). Carbonato de sodio (Na2CO3). Bicarbonato de sodio (NaHCO3). Sosa c�ustica (NaOH). El hidr�xido de sodio, m�s conocido como soda c�ustica, es una base muy fuerte y corrosiva usada en productos destinados a la limpieza de desag�es y al desengrase de hornos. Cuando se disuelve en agua produce una reacci�n muy exot�rmica (-42,9 kJ/mol). Su poder corrosivo hace de la soda c�ustica un compuesto letal para los tejidos vivos y los compuestos org�nicos, e incluso puede atacar al vidrio en caso de que el contacto sea permanente. En presencia del di�xido de carbono atmosf�rico produce carbonato de sodio, por lo que sus soluciones son poco estables. Nitrato de sodio (NaNO3). Tiosulfato de sodio (Na2S2O3 � 5H2O). B�rax (Na2B4O7 � 10H2O). Yoduro de sodio (NaI)

28. Sodio en la dieta La mayor fuente de sodio es el cloruro de sodio o una raci�n com�n de sal, del cual el sodio constituye el 40%. Sin embargo, todos los alimentos contienen sodio en forma natural, siendo m�s predominante la concentraci�n en alimentos de origen animal que vegetal. Aproximadamente 3 gr. de sodio est�n contenidos en los alimentos que se consumen diariamente, sin la adici�n de cloruro de sodio o sal com�n, esto es importante considerarlo en pacientes que tengan una restricci�n o disminuci�n en la ingesta de sal diaria (pacientes nefr�patas, diab�ticos, hipertensos). El requerimiento de sodio es de 500 mg /d�a aproximadamente (3). La mayor�a de las personas consumen m�s sodio que el que fisiol�gicamente necesitan, para ciertas personas con presi�n arterial sensible al sodio, esta cantidad extra puede causar efectos negativos sobre la salud.

29. REFERENCIAS AOAC Official Method 985.35. AOAC Official Methods of Analysis (2005). Cp. 50, p.15. M Series Atomic Absorption, Manual de operaci�n,1999-2006 Thermo Electron Manufacturing Ltda. Spectrometers Manual de M�todos, 9499 230 24011, Issue 4 280804. Thermo Electron Corporation

30. Optimizaci�n del equipo 1.- Realizar la puesta a punto y optimizaci�n de las condiciones del espectrofot�metro (ajuste de quemador y l�mpara) para el metal a determinar siguiendo las indicaciones del manual o instructivo del equipo de medici�n. 2. Aspirar por el capilar del quemador blanco y haga autocero. Ajustar la sensibilidad con concentraci�n de est�ndar referencial indicado en el manual para lograr la m�xima sensibilidad. 3. Aspirar las soluciones est�ndares de la curva de calibraci�n en orden decreciente por el capilar del quemador y leer en E.A.A. Para realizar la calibraci�n se deben usar a lo menos 3 est�ndar y un blanco. El coeficiente de correlaci�n de la curva de regresi�n lineal debe ser > 0,99. 4. Aceptar curva de calibraci�n, aspirar un material de referencia control o una soluci�n control del analito a analizar, verificar que se encuentra dentro del rango de aceptabilidad. 5. Proceder a realizar las lecturas de las muestras en el EAA. 6. Las lecturas son obtenidas por interpolaci�n desde la curva de calibraci�n y est�n expresados en mg/L del analito correspondiente. 7. En caso, de que el valor este fuera de rango del m�ximo de la curva de calibraci�n, realice una diluci�n y registre el valor del factor de diluci�n (F.D.) aplicado. 8. Registre los valores obtenidos.

31. Reactivos 6.3.1. Soluci�n est�ndar stock comercial de multielementos de metales, 100 mg/L, certificada. 6.3.2. Soluci�n est�ndar stock comercial de Sodio 1000 mg/L, certificada. 6.3.3. Gases calidad AAS: Acetileno 99.99% , Oxido nitroso 99.99%. 6.3.4. Agua grado reactivo, destilada o desionizada, tipo I. 6.3.5. Acido n�trico (HNO3) 65% 14 N, calidad AAS.(suprapur) 6.3.6. Acido clorh�drico (HCl) 37%, p.a. 6.3.7. Oxido de lantano (La2O3), 99.99%, calidad AAS. 6.3.8. Soluci�n de cloruro de lantano ( LaCl3, 1% p/v): Pesar 11,7 g (+/- 100mg) de La2O3 y llevar a un matraz aforado de 1L, agregar un poco de agua grado reactivo para disolver el polvo, agregar bajo campana lentamente 50 mL de HCl 37% ( Precauci�n: �Reacci�n exot�rmica!). Agitar suavemente, hasta disolver todo el reactivo y luego aforar con agua grado reactivo. Estable 6 meses a temperatura ambiente. 6.3.9. Soluci�n de �cido n�trico 20% v/v para eliminaci�n de trazas en lavado de material: En un contenedor de pl�stico para lavar material, agregar 5 l de agua grado reactivo, luego, medir 1L de HNO3 65% con una probeta, verter agitando lentamente al contenedor con el agua grado reactivo y mezclar suavemente. 6.3.10. Soluci�n de �cido n�trico 1M: en un matraz de 1 L agregar unos 200 mL de agua grado reactivo, luego medir 71,5 mL de HNO3 65% 14N y agregar bajo campana lentamente al matraz (Precauci�n: �Reacci�n exot�rmica!), aforar con agua grado reactivo y agitar. Almacenar en frasco vidrio o pl�stico �mbar. Duraci�n 6 meses a temperatura ambiente.

32. Para determinar la selectividad se utiliz� un material de referencia matriz liquida multielementos trazables al NIST, con adici�n de oxido de lantano acorde a la metodolog�a anal�tica, con lo cual se pudo observar que el m�todo presenta una buena selectividad. Selectividad Sodio

34. Determinaci�n de Sodio Digesti�n de la muestra Moler y homogeneizar la muestra .. Pesar exactamente en un crisol + 3 g de muestra dependiendo de la concentraci�n esperada del o los analitos. Registre el peso. Colocar el crisol con la muestra sin tapar en placa calefactora, estufa o mufla a 100� C por 30 minutos. Colocar el crisol con la muestra tapado en mufla a 525�C por un periodo de 3 a 5 hrs (< 8 hrs), hasta obtener cenizas blancas. De obtenerse cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol de 0,5 a 3 mL aproximadamente de HNO3 65%, colocar el crisol destapado en placa calefactora a unos 100�C, hasta evaporar. (realizar procedimiento bajo campana extractora de gases).Luego llevar nuevamente mufla a 525�C por 1 a 2 hrs hasta cenizas blancas. Digerir las cenizas blancas contenidas en el crisol con 5 mL de HNO3 1M en placa calefactora cuantitativamente llevar el licor de cenizas a un matraz aforado de 50 mL, a trav�s de 2 lavados con porciones de alrededor de 3 mL de HNO3 1M, agregar al matraz 5 mL de LaCl3, 1% p/v y aforar con HNO31M. La soluci�n esta lista para ser le�da.

35. Sodio 1

36. Sodio 2

37. Hierro M�todo Espectrofotometr�a de Absorci�n at�mica con Llama

38. Metabolismo del hierro Aunque solo existe en peque�as cantidades en los seres vivos, el hierro ha asumido en papel vital en el crecimiento y en la supervivencia de los mismos y es necesario no solo para lograr una adecuada oxigenacion tisular sino tambi�n para el metabolismo de la mayor parte de las c�lulas. El hierro es el elemento numero 26 en la tabla peri�dica y tiene un peso at�mico de 55,85. Es el cuarto elemento en abundancia y el segundo metal m�s abundante en la corteza terrestre. El hierro fue seleccionado en la evoluci�n de los tiempos de entre muchos metales transicionales para formar la ENERGIA VITAL en la fisiolog�a de los vertebrados. En la actualidad con un incremento en el oxigeno atmosf�rico el hierro se encuentra en el medio ambiente casi exclusivamente en forma oxidada (� ferrica � Fe+++) y en esta forma es poco utilizable. En los adultos sanos el hierro corporal total es de 3 a 4 gramos � 35 mg/kg en las mujeres a 50 mg/kg en los hombre se encuentra distribuido en dos formas: 70% como hierro funcional (2.8g): Eritrocitos (65%). Tisular: mioglobinas (4%). Enzimas dependientes del hierro (hem y no hem): 1% Estas son enzimas esenciales para la funci�n de las mitocondrias y que controlan la oxidaci�n intracelular (citocromos, oxidasas del citrocromo, catalasas, peroxidasas). Transferrina (0.1%), la cual se encuentra normalmente saturada en 1/3 con hierro. La mayor atenci�n con relaci�n a este tipo de hierro se ha enfocado hacia el eritr�n, ya que su estatus de hierro puede ser f�cilmente medible y constituye la principal fracci�n del hierro corporal.

39. 30% como hierro de dep�sito (1g): Ferritina (2/3). Hemosiderina (1/3). Hemoglobina: transporta el oxigeno a las celulas. Transferrina: transporta el hierro a trav�s del plasma. Ferritina: principal forma de deposito del hierro en los tejidos. Estudios recientes de disponibilidad del hierro de los alimentos han demostrado que el hierro del hem es absorbido bien, pero el hierro no hem se absorbe en general muy pobremente y este ultimo es el hierro que predomina en la dieta de gran cantidad de gente en el mundo.[cita�requerida] Hem: como hemoglobina y mioglobina, presente principalmente en la carne y derivados. No hem. La absorci�n del hierro hem no es afectada por ningun factor ni dietetico, ni de secreci�n gastrointestinal. Se absorbe tal cual dentro del anillo porfirinico. El hierro es liberado dentro de las celulas de la mucosa por la HEM oxigenasa, enzima que abunda en las celulas intestinales del duodeno. Las absorci�n del hierro no hem, por el contrario se encuentra afectada por una gran contidad de factores dieteticos y de secreci�n gastrointestinal que se analizanran posteriormente. El hierro procedente de la dieta, especialmente el no hem, es hierro f�rrico y debe ser convertido en hierro ferroso a nivel g�strico antes que ocurra su absorci�n en esta forma (hierro ferroso) a nivel duodenal principalmente. Otros factores, independientes de la dieta que pueden influir en la absorci�n del hierro son:

40. Funciones Hierro El hierro se encuentra en pr�cticamente todos los seres vivos y cumple numerosas y variadas funciones. Hay distintas prote�nas que contienen el grupo hemo, que consiste en el ligando porfirina con un �tomo de hierro. Algunos ejemplos: La hemoglobina y la mioglobina; la primera transporta ox�geno, O2, y la segunda lo almacena. Los citocromos; los citocromos c catalizan la reducci�n de ox�geno a agua. Los citocromos P450 catalizan la oxidaci�n de compuestos hidrof�bicos, como f�rmacos o drogas, para que puedan ser excretados, y participan en la s�ntesis de distintas mol�culas. Las peroxidasas y catalasas catalizan la oxidaci�n de per�xidos, H2O2, que son t�xicos. Ejemplo de centro de una prote�na de Fe/S (ferredoxina) Las prote�nas de hierro/azufre (Fe/S) participan en procesos de transferencia de electrones. Tambi�n se puede encontrar prote�nas en donde �tomos de hierro se enlazan entre s� a trav�s de enlaces puente de ox�geno. Se denominan prote�nas Fe-O-Fe. Algunos ejemplos: Las bacterias metanotr�ficas, que emplean el metano, CH4, como fuente de energ�a y de carbono, usan prote�nas de este tipo, llamadas monooxigenasas, para catalizar la oxidaci�n de este metano. La hemeritrina transporta ox�geno en algunos organismos marinos. Algunas ribonucle�tido reductasas contienen hierro. Catalizan la formaci�n de desoxinucle�tidos. Los animales para transportar el hierro dentro del cuerpo emplean unas prote�nas llamadas transferrinas. Para almacenarlo emplean la ferritina y la hemosiderina. El hierro entra en el organismo al ser absorbido en el intestino delgado y es transportado o almacenado por esas prote�nas. La mayor parte del hierro se reutiliza y muy poco se excreta. Tanto el exceso como el defecto de hierro pueden provocar problemas en el organismo. El envenamiento por hierro ocurre debido a la ingesta exagerada de est� (como suplemento en el tratamiento de anemias). La hemocromatosis corresponde a una enfermedad de origen gen�tico, en la cual ocurre una excesiva absorci�n del hierro, el cual se deposita en el h�gado, causando disfunci�n de este y eventualmente llegando a la cirrosis hep�tica. En las transfusiones de sangre se emplean ligandos que forman con el hierro complejos de una alta estabilidad para evitar que quede demasiado hierro libre. Estos ligandos se conocen como sider�foros. Muchos microorganismos emplean estos sider�foros para captar el hierro que necesitan. Tambi�n se pueden emplear como antibi�ticos, pues no dejan hierro libre disponible.

41. REFERENCIAS Official methods of analysis AOAC 15 th edition, vol 2, p�g 1106,1107, a�o 1990 M Series Atomic Absorption, Manual de operaci�n,1999-2006 Thermo Electron Manufacturing Ltda. Spectrometers Manual de M�todos, 9499 230 24011, Issue 4 280804. Thermo Electron Corporation

42. Selectividad Dada que las l�neas de emisi�n de la l�mpara del c�todo hueco de Fe son muy estrechas es rara la interferencia. Si interfiere en la dispersi�n de la luz la combusti�n incompleta de la matriz org�nica o Interferente espectral hierro 213,859 nm y el Zinc 213,856 lo cual produce una sobreposici�n de 0,003 nm Para determinar la selectividad se utiliz� una matriz de harina sin fortificar (grado de extracci�n, 78%), y una matriz de harina con adici�n de est�ndar de hierro y sulfato y pirofosfato de hierro con lo cual se pudo observar que el m�todo presenta una buena selectividad, ya que las matrices no se ven afectadas por la presencia de otros analitos interferentes

43. Reactivos, insumos Matraces aforados de 50 mL Piseta Esp�tula, toalla absorbente, plum�n permanente C�psulas de porcelana para digesti�n de 25cm de di�metro Elementos de seguridad como guantes y anteojos Balanza anal�tica sensibilidad 0.1 mg Campana de extracci�n de gases Espectrofot�metro de absorci�n at�mica con llama Homogeneizador de muestras Plancha calefactora Agua para an�lisis, desionizada �cido clorh�drico 37 % p.a. �cido n�trico 65% p.a Est�ndar de Hierro o multielementos L�mpara de hierro Micropipeta de 100ul a 1000 ul

44. Curva de calibraci�n de est�ndares 1.- Est�ndares de hierro soluci�n concentrada de 1000 mg/L. o St multielemenos 100 ppm 2.- Est�ndar de 5 mg/L: tomar 0,5 mL del est�ndar concentrado de 1000 mg/L + 5 mL de HCL concentrado y aforar a 100 mL con agua desionizada. 3.- Est�ndar de 2 mg/L: tomar 0,2 mL del est�ndar concentrado de 1000 mg/L + 5 mL de HCL concentrado y aforar a 100 mL con agua desionizada. 4.- Est�ndar de 1 mg/L: tomar 0,1 mL del est�ndar concentrado de 1000 mg/L + 5 mL de HCL concentrado y aforar a 100 mL con agua desionizada

45. Condiciones del equipo de FLAA Longitud de Onda 248,3 nm Franja de paso (slite) 0,2 nm Tipo de Llama Aire-acetileno Flujo de Combustible 0,8 a1,0 L/min Corriente de la l�mpara 75 Tipo de se�al Continua T� de ignici�n 800�C T� de atomizaci�n 2300 �C Corrector de background on

46. Determinaci�n de Hierro Digesti�n de la muestra Moler y homogeneizar la muestra .. Pesar exactamente en un crisol + 3 g de muestra dependiendo de la concentraci�n esperada del o los analitos. Registre el peso. Colocar el crisol con la muestra sin tapar en placa calefactora, estufa o mufla a 100�C por 30 minutos. Colocar el crisol con la muestra tapado en mufla a 550�C por un periodo de 5 a 6 hrs (< 8 hrs), hasta obtener cenizas blancas. De obtenerse cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol de 0,5 a 3 mL aproximadamente de HCL 1:1 colocar el crisol destapado en placa calefactora a unos 100�C, hasta evaporar. (realizar procedimiento bajo campana extractora de gases).Luego llevar nuevamente mufla a 550�C por 1 a 2 hrs hasta cenizas blancas. Digerir las cenizas blancas contenidas en el crisol con 5 mL de HCL 1:1 en placa calefactora cuantitativamente llevar el licor de cenizas a un matraz aforado de 50 mL, a trav�s de 2 lavados con porciones de alrededor de 3 mL de HCL 1:1, aforar con agua. La soluci�n esta lista para ser le�da.

48. Interpretaci�n, c�lculos, expresi�n e informede los resultados Para calcular la concentraci�n de sodio o hierro en la muestra en mg/kg, aplique la siguiente formula: mg/Kg del analito = L x 50 x F.D. P L: Lectura de la concentraci�n en mg/L obtenida por la interpolaci�n de la curva de calibraci�n. FD: Factor de diluci�n. En caso de no realizar ninguna diluci�n, es igual a 1. P: Peso de la muestra en gramos Los resultados obtenidos se expresan en muestras s�lidas mg/Kg o en muestras l�quidas mg/L ENO sodio en mg/100g y mg/porci�n de consumo habitual

49. �CIDO ASC�RBICO M�todo J.Tillman

50. La Vitamina C o enanti�mero L del �cido asc�rbico, es un nutriente esencial para los primates superiores y un peque�o n�mero de otras especies. La presencia de esta vitamina es requerida para un cierto n�mero de reacciones metab�licas en todos los animales y plantas y es creada internamente por casi todos los organismos, siendo los humanos una notable excepci�n. Es ampliamente sabido que su deficiencia causa escorbuto en humanos,1 2 3 de ah� el nombre de asc�rbico que se le da al �cido. Es tambi�n ampliamente usado como aditivo alimentario. El farmac�foro de la vitamina C es el ion ascorbato. En organismos vivos, el ascorbato es un antioxidante, pues protege el cuerpo contra la oxidaci�n, y es un cofactor en varias reaciones enzim�ticas vitales.

51. ayuda al desarrollo de dientes y enc�as, huesos, cart�lagos, a la absorci�n del hierro, al crecimiento y reparaci�n del tejido conectivo normal (piel m�s suave, por la union de las c�lulas que necesitan esta vitamina para unirse), a la producci�n de col�geno (actuando como cofactor en la hidroxilaci�n de los amino�cidos lisina y prolina), metabolizaci�n de grasas, la cicatrizaci�n de heridas. Su carencia ocasiona el escorbuto, tambi�n resulta esta vitamina un factor potenciador para el sistema inmune aunque algunos estudios ponen en duda esta �ltima actividad de la vitamina C.

52. Indicaciones La Vitamina C es esencial para el desarrollo y mantenimiento del organismo, por lo que su consumo es obligatorio para mantener una buena salud. La vitamina C sirve para: Evitar el envejecimiento prematuro (proteger el tejido conectivo, la "piel" de los vasos sangu�neos). Facilita la absorci�n de otras vitaminas y minerales. Antioxidante. Evita las enfermedades degenerativas tales como arteriosclerosis, c�ncer, enfermedad de Alzheimer. Evita las enfermedades card�acas (tema tratado m�s adelante). Desde los descubrimientos de Linus Pauling se aseveraba que la vitamina C reforzaba el sistema inmune y preven�a la gripe, pero investigaciones realizadas en los 1990s parecen refutar esta teor�a y, en todo caso, han demostrado que el consumo en exceso (a diferencia de lo preconizado por Pauling y sus seguidores) de suplementos de vitamina C son poco recomendables, porque,entre otras cosas, un consumo excesivo puede provocar alteraciones gastrointestinales. Requerimientos diarios El ser humano parece ser extremadamente eficiente en la reutilizaci�n de la vitamina C, por lo que sus requerimientos son 50 veces menores que en el resto de los simios. Al ser una vitamina hidrosoluble su eliminaci�n por el ri��n por diuresis es extremadamente eficaz, por lo que los excesos se pueden eliminar en menos de cuatro horas. Todo ello hace que haya muy poco consenso en cual es la cantidad m�nima y la cantidad m�xima. Prueba de ellos damos las siguientes referencias: 40 miligramos por d�a: Food Standards Agency1 del Reino Unido 45 miligramos por d�a: La Organizaci�n Mundial de la Salud4 60�95 miligramos por d�a: National Academy of Sciences5 de los Estados Unidos. Segun este organismo no se deben exceder los 2000 miligramos por d�a. 400 miligramos por d�a: the Linus Pauling Institute.6 1.000 miligramos por d�a: Profesor Roc Ordman, para la investigaci�n de los radicales libres.7 3.000 miligramos por d�a (hasta 300.000 mg para enfermos): La Fundaci�n para la vitamina C.8 6.000�12.000 miligramos por d�a: Thomas E. Levy, Colorado Integrative Medical Centre.9 6.000�18.000 miligramos por d�a: Dosis que ingiere Linus Pauling.10 3.000�200.000 miligramos por d�a: Robert Cathcart va subiendo la dosis hasta que aparece una diarrea. Entonces recomienda la dosis m�s elevada que no cause diarrea al paciente.11

53. Efectos Adversos Se considera que las necesidades diarias de �cido asc�rbico para un adulto no exceden de los 60 mg y que cantidades superiores a los 3 g diarios causan acidificaci�n de la orina e incrementan el consiguiente riesgo de c�lculos urinarios

54. Otros Usos El �cido asc�rbico y sus sales ascorbatos de sodio, potasio y calcio se utilizan de forma generalizada como antioxidantes y aditivos. Estos compuestos son solubles en agua por lo que no protegen a las grasas de la oxidaci�n; para este prop�sito pueden utilizarse los �steres del �cido asc�rbico solubles en grasas con �cidos grasos de cadena larga (palmitato y estearato de ascorbilo). Principales fuentes naturales Las principales fuentes naturales de vitamina C que actualmente se conocen son todas vegetales, principalmente ciertas frutas (las que poseen colores rojos o azulados suelen ser ricas en �cido asc�rbico), a continuaci�n se enumeran los principales vegetales que hacen aporte de esta vitamina: " � grosella negra (Ribes nigrum), los aj�s, chiles, pimientos, morrones, pimentones, el perejil, la guayaba, el fruto kiwi, el br�col o broccoli (Brassica oleracea italica), el h�brido llamado loganberry, la grosella (Ribes rubrum) el repollito de Bruselas tambi�n conocido como col de Bruselas, el goji (Lycium barbarum), el lichi (Litchi chinensis) entre otros, sin embargo en gran parte del mundo de cultura "Occidental" las fuentes m�s comunes para obtener vitamina C suelen ser los citrus: lim�n, naranja, pomelo, bergamota y, fuera de los citrus, el tomate.

55. la vitamina C es una de las vitaminas que intervienen en el funcionamiento del sistema inmunol�gico, como lo hacen la vitamina A y la tiamina. Tambi�n es muy importante como vitamina antioxidante, lo que de una u otra manera protege a nuestro organismo de radicales libres u otras sustancias t�xicas. Por otro lado, al ser hidrosoluble, el exceso es f�cilmente eliminado en la orina. Como curiosidad puede se�alarse que esta vitamina s�lo es esencial en unos pocos animales: los monos antropoides, el ser humano que ha perdido la capacidad de sintetizarla naturalmente en su cuerpo; el ruise�or chino, una especie de trucha, los cuyes y los murci�lagos frug�voros. Tipos de vitamina La vitamina C se divide en naturales y sint�ticas. Las naturales se dividen en �cido asc�rbico y ascorbato de sodio; por su parte las sint�ticas pueden tener distintas variaciones. Las ventajas de la vitamina C sint�ticas es su bajo precio y su fabricaci�n pues su materia prima es el petr�leo, sus desventajas son su baja efectividad y los efectos secundarios que conlleva el consumo de elementos minerales en reemplazo de vegetales. En cambio, la vitamina C natural es sumamente efectiva, y de muy bajo precio pues est� presente en casi toda las frutas y vegetales (c�tricos de preferencia); su problema radica en que al extraerse y convertirse en cristales toma un fuerte sabor a lim�n no bien tolerado por personas con sensibilidad en su estomago

56. REFERENCIAS Association of Official Analytical Chemists 985.33 (1995) United State Pharmacopeia U.S.P. XXIII Methods for the determination of vitamins in food, G. Brubacher Muller Mulot and A.T. Southgate

57. Selectividad �cido Asc�rbico M�todo J.Tillman La determinaci�n oxidim�trica no es muy selectiva ya que la presencia de otros analitos interferentes (compuestos reductores, SO2,etc) tienden a producir gastos elevados del titulante 2,6DFIF, con lo cual generalmente da como resultados valores sobreestimados.

58. El m�todo es aplicable a productos con o sin almid�n productos heterog�neos, verduras, frutas, leche y productos a base de leche.

59. Reactivos 1.- �cido L(+) asc�rbico est�ndar 2.- �cido meta-fosf�rico p.a 3.- �cido ac�tico p.a 4.- 2,6-diclorofenol-indofenol sal s�dica p.a 5.- EDTA sal s�dica del �cido etilendiaminotetraac�tico. 6.- Soluci�n est�ndar de �cido asc�rbico.- 1mg/mL. Pesar con exactitud 50 mg de Acido L(+) asc�rbico est�ndar (U.S.P., B.P.). Transferir a un matraz volum�trico de 50 mL. Diluir al volumen con la soluci�n de �cido meta-fosf�rico al 2%. 7.- Soluci�n �cido meta-fosf�rico.- Disolver con agitaci�n 15 mg de pellets de HPO3 glacial en 40 mL de �cido ac�tico glacial y 150 mL de H2O. Aforar a 250 mL con H2O y filtrar r�pidamente a trav�s de un papel filtro plegado cuantitativo (Whatman N� 541, r�pido, 18,5 cm u otro equivalente). 8.- Soluci�n de EDTA.- Disolver con agitaci�n 0,9 g de EDTA en 200 mL de H2O. 9.- Soluci�n precipitante.- Mezclar inmediatamente antes de su uso en vol�menes iguales de la soluci�n de EDTA y �cido meta-fosf�rico.

60. Extracci�n Extracci�n del �cido asc�rbico mediante �cido meta-fosf�rico, en donde el �cido asc�rbico reduce el indicador de oxido-reducci�n 2,6-diclorofenol-indofenol, eliminando el color azul inicial del compuesto en estado s�lido en soluci�n neutra y alcalina; la soluci�n en medio �cido es de coloraci�n rosada y se reduce al derivado leuco, incoloro, el �cido asc�rbico se oxida a �cido dehidroasc�rbico, lo cual permite su determinaci�n por volumetr�a oxidim�trica

61. Disolver 0,0625 de sal s�dica en 50 mL de H2O en un matraz volum�trico de 250 mL al cual se le adiciona previamente 0,0525 g de NaHCO3 grado reactivo. Agite vigorosamente, cuando el colorante est� disuelto, diluya a 250 mL con H2O. Filtrar a una botella �mbar utilizando el papel filtro. Guardar bajo refrigeraci�n.

62. Transfiera 2,0 mL de soluci�n est�ndar Acido L(+) asc�rbico a cada uno de los 3 matraces erlenmeyer que contienen 5 mL de la soluci�n precipitante cada uno. Empleando una bureta de 25 mL graduada en 0,05 mL y con una llave de vidrio o tefl�n, titular r�pidamente con la soluci�n est�ndar de indofenol hasta obtener una coloraci�n rosada p�lida que persista por 5 segundos.(Cada titulaci�n debe requerir aproximadamente 15 mL, y debe corroborarse dentro de ? 0,1 mL). Titule 3 blancos compuestos de 7 mL de soluci�n precipitante m�s 15 mL de H2O. El blanco promedio es 0,1 mL. Calcule el equivalente del colorante indofenol (F), equivalente a �cido asc�rbico de un mL de la soluci�n est�ndar de indofenol. mL DFIF de la titulaci�n del est�ndar de �cido asc�rbico - mL DFIF de la titulaci�n del blanco = mL DFIF equivalente a 2 mg de �cido asc�rbico (A)

63.  Preparaci�n de la porci�n de ensayo. Pesar 10 g con una precisi�n de 0,1 g una cantidad del producto a analizar que contenga aproximadamente 5 a 10 mg de �cido asc�rbico en un matraz de 100 mL con H2O. Pipetear 20-40 mL de la disoluci�n y un volumen igual de la soluci�n precipitante a un vaso de precipitado de 125 mL. Designar el volumen como v y el de la disoluci�n de la muestra como E. Mezclar y centrifugar a 5.000 rpm por 5 - 10 min. Filtrar el sobrenadante utilizando papel filtro. Designar al filtrado como la soluci�n de ensayo. La preparaci�n debe realizarse inmediatamente antes de la determinaci�n.

64. Ej. verdura, fruta Homogeneizar una muestra de 50 a 100 g con un volumen de �cido meta-fosf�rico de 10% representando 1/5 del volumen total es decir 50 mL de �cido meta-fosf�rico para un matraz de 250 mL y enrasar con H2O destilada. Centrifugar y/o filtrar la soluci�n obtenida sobre un filtro plegado.

65.  Pipetear tres alicuotas de 10 mL, de cada soluci�n de ensayo (V), llevar cada una de las alicuotas a matraces erlenmeyer separados y titular con el DFIF (X). En forma similar, titular 2 blancos compuestos cada uno de 10 mL de la soluci�n precipitante y 10 mL de H2O. Adem�s agregu� un volumen de H2O equivalente a los mL de la soluci�n est�ndar de indofenol usados en la titulaci�n de la soluci�n de ensayo. Titule con la soluci�n est�ndar de indofenol hasta el mismo color del punto final observado en la titulaci�n de la al�cuota est�ndar (B). El color rosa debe permanecer a lo menos 5 segundos.

66. Cuantificaci�n e Identificaci�n  Ejemplo leche en polvo mg �cido asc�rbico/100 g de muestra = (X-B) x (A/E) x (V/Y) x (100/0,10) donde X = mL promedio obtenido en la titulaci�n de ensayo; B = mL promedio obtenido de la titulaci�n del blanco A = mg de �cido asc�rbico equivalente a 1 mL de soluci�n est�ndar de indofenol E = volumen de la muestra disuelta V = volumen de la muestra de ensayo Y = volumen de soluci�n de ensayo titulada = 10 mL (100/0,10) = factor para expresar el contenido en 100 g de producto final. Expresi�n de Resultados. Expresar el contenido de �cido asc�rbico en mg /100 g de producto final.

67. Par�metros

68. Control de Calidad Se efectuar�n controles para comprobar la validez de los ensayos realizados con el m�todo anal�tico recogido en este procedimiento. Nivel I: Ensayos de intercomparaci�n, utilizaci�n de materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, seg�n disponibilidad. Nivel II: Materiales de referencia con o sin certificaci�n externa y muestras fortificadas por el analista en la validaci�n. Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye: Control de blanco al inicio de las lecturas Control de est�ndar de concentraci�n conocida Repetici�n del est�ndar como control por cada diez muestras.