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DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE. Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris. Principe de la CGH array. Marquage des ADN. Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logiciel adapté.

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DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

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Presentation Transcript

  1. DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris

  2. Principe de la CGH array Marquagedes ADN Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logicieladapté ADNtémoin*Cy5 ADNpatient *Cy3 Lavage Lecture parscanner Cohybridation

  3. Wolf-Hirschhorn Cri du Chat Williams-Beuren Langer-Giedion Miller-Dieker 13 DiGeorge 18 Smith-Magenis Prader-Willi / Angelman 21 X Y

  4. Quelle technologie utilise Prenatal BoBs? Prenatal B o B s ACs n ead • BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. • 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

  5. J1 Marquage de l’ADN à la Biotine Random Primer Solution Biotin-dNTP Mix Polymerase Sample Diluent Biotine

  6. Purification de l’ADN Colonne avec filtre Biotine Kit de purification Purelink INVITROGEN

  7. Hybridation de l’ADN sur les billes Dénaturation 5 mn à 85°C Hybridation à 52°C à 1200 rpm 16 à 20H Sonde fixée sur les micro billes Biotine

  8. J2 Lavages Wash Buffer 1 Elimination de l’ADN non hybridé Filtre 0,45 µm en µplaque ADN marqué non-hybridé

  9. Révélation du signal Phycoérythrine Streptavidine Reporter Concentrate Reporter Diluent 37°C 1200 rpm Biotine

  10. Lavages Wash Buffer 2 Filtre 0,45 µm en µplaque Streptavidine non couplée

  11. Lectures des billes Lecture d’une plaque complète = 2h

  12. Lectures des billes Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN Le laser rouge identifie le signal de la bille

  13. Profil féminin normal

  14. Profil masculin anormal

  15. Notre expérienceà Robert Debré

  16. BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

  17. Nos résultatsDe avril 2011 à juillet 2012

  18. Intérêts • Rendu de résultats rapide • Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL de LA ou 1 petite villosité • Comparaison avec des références mâles et femelles • Jusqu’à 44 patients par plaque • Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8 sondes par région étudiée • Screening plus large (dont contrôles sur quelques autosomes)

  19. Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus

  20. Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un RCIU à 34SA

  21. Inconvénients • Non détection des translocations équilibrées ? • Difficulté d’interprétation des triploïdies • Technique très manuelle • Technique coûteuse ? • Certaines microdel étudiées inutiles ?

  22. Exemple d’une triploïdie chez un fœtus

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