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Accumulation Timer

Accumulation Timer. iGEM Chiba 2008. 入力班：小林あおい、香取崇広 送受信班：川崎浩平、冨永将大、井山佳美 出力班：福冨浩樹、杉山まい. Accumulation Timer の作成. ・ 放射線、紫外線、毒性物質 …. 　一過性であり、被爆量（量 × 時間）に依存する汚染 　　↓ バクテリアによる環境汚染計測 　・従来型センサ；入力強度センサ 　・我々のセンサ；累積計 時間軸の付加. タイマーの作成. Quorum Sensing. Sender→Receiver ；化学分子の送信

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Presentation Transcript

  1. Accumulation Timer iGEM Chiba 2008 入力班：小林あおい、香取崇広 送受信班：川崎浩平、冨永将大、井山佳美 出力班：福冨浩樹、杉山まい

  2. Accumulation Timerの作成 ・放射線、紫外線、毒性物質…. 　一過性であり、被爆量（量×時間）に依存する汚染 　　↓ バクテリアによる環境汚染計測 　・従来型センサ；入力強度センサ 　・我々のセンサ；累積計 時間軸の付加 タイマーの作成

  3. Quorum Sensing • Sender→Receiver；化学分子の送信 仮説：十分量の分子が溜まらないと、Receiverは感知しない 本研究のポイント 　話し手（Sender）と聞き手（Receiver）の通信感度を適正化 →さまざまな時間タイマーの作成

  4. システム内容 UV

  5. Accumulation Timerの条件 ①前回の出力が打ち消されない Accumulated effect To our body Off時でも前回の onの記録を保存 Input Value Time

  6. Accumulation Timerの条件 ②on時の出力は一定 ③on/offの区切りしっかり ④一定時間を超えたことを提示する Signal conc. Time Time on off

  7. 入力チーム 小林あおい・香取崇広 SOS Response

  8. UVに曝露された時間を計る！ 入力 Sensor 入力として設定したいもの　・・・　「一過性の情報」 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・　可視光(難) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・　紫外線 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・　温度（細胞の成育状況に影響）

  9. U V ON UV Sensor(PrecA) RecA LexA LexA OFF RecA LexA UV LexA ssDNA

  10. BBa_J22136を用いたUV照射実験 16W 254nm ? J/m2 2.5cm 7.5cm

  11. PrecAの懸案事項 ・　leakyである ・・・XL10G(recA－), 48hでRFP発現 ・　UVによるswitch on 難.

  12. Sub Cloning中 U V ON UV Sensor(PcI) RecA cI cI OFF RecA cI UV cI ssDNA

  13. UV によるDeath Curve作成 ＜BW⊿tdk (RecA+)＞ 3 ml LB medium ＜UV Source＞ 7.5 cm UVGL-58 Mineralight Lamp (multiband UV-254/366 nm; San Gabriel, CA) 100V, 0.16A

  14. UVによるDeath Curve作成 105希釈 104希釈 CFU －UV 105希釈 0 1h 2h 4h 6h 8h Irradiation Time 10 min 30 min

  15. 入力をUVにすることの懸案事項 ・　２ｈで大腸菌全滅　・・・　２ｈ以上のタイマー不可. ・　AHLがUVで分解される!?・・・NOWGOING Ex. 3OC6HSL モデルとしてアラビノースプロモーターを用意する.

  16. 送受信チーム 冨永将大・川崎浩平・井山佳美 SOS Response

  17. 全体像 AHL 送受信システムの作成

  18. 目標:1hでは光らないが　　一定時間ONが続くと光る目標:1hでは光らないが　　一定時間ONが続くと光る 通常AHL通信 1 hour Receiver(AHL感受性)変更通信 Still inactive ON OFF 4 hours… 1 hour ON ON Still inactive

  19. 求められること AHL 5 hours… ①AHL合成量 （合成速度）を下げる ②感受性を下げる →シグナル 分子の変更 →RBSの調整

  20. シグナル伝達：Quorum sensing Autoinducer synthase Recepter Protein AHL 基本構造 由来生物 V.Fisheri luxI(OHHL) LuxI LuxR LasI(OdDHL) P.aeruginosa lasR lasI R.leguminosarum cinI cinR cinI RhlI(BHL) P.aeruginosa RhlR RhlI

  21. シグナル分子(=AHL)の変更 《Cross talkを利用した実験》 Autoinducer synthase Recepter Protein LuxI LuxR lasR lasI cinR cinI RhlR RhlI

  22. 実験の流れ テスト準備（8/17~） バラバラなパーツの組み直し CrossTalkテスト（9/2~） Lux Las Rhl Cin Lux Las Rhl Cin Today タイムディレイテスト（9/8~）

  23. 今週の成果1 : パーツ合成 Biobrickから新たなパーツを合成 Plac RhlI Ligation Plac+RBS RhlI+LVA RBS + CinI+LVA, RhlI+LVA CinI+LVA RhlI, CinI LasI

  24. 今週の成果2 : Cross-talkの確認 Autoinducer synthase Recepter Protein RhlI OK LuxR 未実施： LuxI, luxI+LVA, CinI, LasI+LVA RhlI+LVA ？ ？ cinI+LVA OK LasI

  25. Cross-talkテスト1 Sender Receiver = LuxR 8H (Sender:Receiver=1:1) 8H:Spindown→12H

  26. Cross-talkテスト2 Sender Receiver = LuxR 5H (Sender:Receiver=1:1) 5H TM

  27. タイムディレイテスト Sender : Lux, Las, Cin, Rhl Reciever : Lux LuxI LasI RhlI CinI Sender : Receiver 1 : 1 時間 / hour 一定時間ごとに蛍光強度測定

  28. 今後の予定 １、タイムディレイテスト ２、遺伝子発現数の制御 →プラスミドベクターの変更 ３、転写量の制御 →RBSの交換

  29. 出力チーム 福冨浩樹・杉山まい SOS Response

  30. どのような出力が必要？ 出力となるタンパクの発現から、発色などを確認できるまでの時間が短い出力

  31. 出力 ? ? ? ～ ※時間は固体培地上で目視で来るまでの時間

  32. Response Test wash Pick Glucose 0.2% M9,IPTG 0.1mM (X-Gal 80μg/mL) Glucose 0.2% UVで励起して観察 コロニーリフト IPTG 0.1mM (X-Gal 20μg/mL)

  33. テスト結果 GFPuvが最も早く発現

  34. Note：蛍光たんぱく • GFPuvが最も早く発現しているように見えた • 適切な励起光で励起していたために早かった？ • VenusやmCherryも適切な励起光であれば、さらに早く観察されることが考えられる

  35. Note:LacZ • LacZ-Xgalの出力までが遅いのはXgal濃度が低いため？ • Xgal 20μg/mLを40μg/mL,80μg/mLにしてレスポンスタイム計測 80mM○ IPTG なし 40mM○ 3hour

  36. Note:Luciferase • Renilla Luciferaseの反応：ルシフェリンの酸化 • Coelenterazine:膜透過性がある β-Cyclodextrinを加えると10倍水に溶ける Renilla Luciferase λ=480nM Coelenterazine β-Cyclodextrin

  37. まとめ • 現在一番早いもの・・・GFPuv (発色まで1.5h) • LacZやLuciferaseは基質濃度に左右される • 基質濃度を上げることで1.5hより早く発色することは考えられる。 To Do • Luciferaseのタイムレスポンスの比較 ルシフェリンの濃度を上げて実験

  38. いつ終わるのか？ • UVを入力とする場合、UVに耐えられる安定な出力が求められる • ある程度候補を挙げたらUVに対する安定性を調べたい。 • 来週までには大まかな結果を出し、採用する出力を決定したい。

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