Przydatność diagnostyczna oznaczania niebiałkowych związków azotowych

1. Przydatność diagnostyczna oznaczania niebiałkowych związków azotowych Maciej Śpiewakowski III rok OAM

2. Niebiałkowe związki azotu • Mocznik • Kreatynina • Kwas moczowy • Amoniak

3. Mocznik • diamid kwasu węglowego • syntetyzowany w wątrobie, usuwany głównie przez nerki • swobodnie dyfunduje przez błony komórkowe • ok. 40% mocznika przesączonego w kłębuszkach nerkowych ulega resorpcji zwrotnej, a także może być wydzielany w kanalikach nerkowych • stanowi ok. 45% azotu pozabiałkowego osocza • prawidłowe stężenie w surowicy (10-50 mg/dL) – zależy od: - perfuzji nerek i wielkości diurezy (klirensu wolnej wody) - wielkości GFR - szybkości syntezy mocznika – zależy bezpośrednio od podaży białka w diecie i katabolizmu białkowego

4. Oznaczanie mocznika • Metoda chemiczna - oparta na reakcji Fearon’a, w której diacetyl kondensuje z mocznikiem tworząc barwną (żółtą) pochodną diazynową absorbującą przy 540 nm - diacetyljest niestabilny – jest produkowany w środowisku reakcji z diacetymonoksymu w środowisku kwaśnym - ma ograniczoną swoistość (cytrulina i alantoina także dają reakcję dodatnią) - szybko następuje zmniejszenie natężenia barwy - reakcja przebiega w 100°C – okres ogrzewania zależy od stężenia mocznika - nie stosuje się do prawa Lamberta-Beera

5. Oznaczanie mocznika • Metoda enzymatyczna - metoda pośrednia – wykorzystuje ureazę hydrolizującą mocznik do CO2 i NH4+, który jest następnie oznaczany podczas reakcji Berthelota lub z dehydrogenazą glutaminianową (GLDH): GLDH NH4+ + α-ketoglutaran+ NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H2O [test optyczny prosty - szybkość zmiany absorbancji przy długości fali 340 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia mocznika]

6. Wartości referencyjne mocznika Ze względów metodycznych wartością oznaczaną jest azot mocznika: BUN (bloodureanitrogen). Przelicznik BUN na stężenie mocznika: 0,46 (mg/dL) lub 2,14 (mmol/L). - zdrowi dorośli: 6-20 mg/dL - dorośli powyżej 60 roku życia: 8-23 mg/dL - ciężarne i dzieci – lekko obniżone stężenia w stosunku do zdrowych dorosłych - nieco wyższe stężenia u mężczyzn niż u kobiet

7. Mocznikprzydatność diagnostyczna • Nieprawidłowe stężenia mocznika Obniżone stężenie mocznika w surowicy: - zaburzenia syntezy mocznika (wyłączone 80-95% miąższu wątroby) - zmniejszona synteza w wątrobie z towarzyszącym zwiększeniem objętości krwi krążącej (przewodnienie) - stany anaboliczne (stosowanie androgenów) - dieta niskobiałkowa Zwiększone stężenie mocznika w surowicy: - nadprodukcja mocznika (masywny rozpad białek tkankowych lub bogatobiałkowadieta, resorpcja białek po krwawieniu do przewodu pokarmowego, steroidoterapia, nadczynność tarczycy) - zmniejszenie perfuzji nerek - odwodnienie - terapia tetracyklinami

8. Mocznikprzydatność diagnostyczna • Wskazania do oznaczania mocznika w surowicy - różnicowanie przednerkowej i pozanerkowejazotemii (współczynnik mocznik/kreatynina) - nasilenie toksemii mocznicowej u chorych z terminalną niewydolnością nerek - u chorych dializowanych w celu oceny stanu metabolicznego i nasilenia katabolizmu białkowego

9. kreatynina • bezwodnik kreatyny • występuje we krwi i w moczu • powstaje w organizmie w wyniku nieenzymatycznego rozpadu fosforanu kreatyny • jest wydalana z organizmu wraz z moczem(średnio wydala się tak ok. 14-26 mg kreatyniny na kilogram masy ciała) • stanowi jeden z markerów biochemicznych pozwalającym monitorować stan nerek

10. Oznaczanie kreatyniny • Metody chemiczne Reakcja Jaffego - kreatynina reaguje z pikrynianem w środowisku alkalicznym tworząc pomarańczowo-czerwony związek kompleksowy (490-500 nm) - mało swoista reakcja - dodatnią reakcję Jaffegodają: kwas askorbinowy, glukoza, ciała ketonowe (interferują najsilniej – gł. acetooctan), białka, pirogronian - interferuje ujemnie bilirubina – dodanie surfaktantu i stosowanie buforów boranowego lub fosforanowego podczas reakcji, zmniejsza ten wpływ. • Metody enzymatyczne

11. Wartości referencyjne kreatyniny • Zależne od zastosowanej metody; dla metody Jaffego: - mężczyźni: 0,9-1,3 mg/dL (80-115 mmol/L) - kobiety: 0,6-1,1 mg/dL (53-97 mmol/L) • Współczynnik przeliczeniowy z mg/dL na mmol/L: 88,4 • Wydalanie kreatyniny z moczem: - mężczyźni: 14-26 mg/kg/24 h (124-230 mmol/kg/24 h) - kobiety: 11-20 mg/kg/24 h (97-177 mmol/kg/24 h)

12. Kreatyninaprzydatność diagnostyczna • Nieprawidłowe stężenia kreatyniny Zwiększone stężenie kreatyniny Przy prawidłowa funkcja nerek: - odwodnienie - akromegalia Przy ostrej niewydolności nerek: - przednerkowa (wstrząs hipowolemiczny, kardiogenny, septyczny, anafilaktyczny) - nerkowa (toksyczne/alergiczne działanie leków, środki cieniujące, mioliza, hemoliza, szpiczak, metale ciężkie, posocznica, rzucawka ciężarnych, choroby układowe, szybko postępujące kłębuszkowe zapalenie nerek) - pozanerkowa (zatrzymanie moczu, narkotyki) Przy przewlekłej niewydolność nerek: kłębuszkowe zapalenie nerek, śródmiąższowe zapalenie nerek, nefropatia cukrzycowa, nadciśnienie tętnicze, choroby tkanki łącznej, nerka szpiczakowa)

13. Kreatyninaprzydatność diagnostyczna • Obniżenie stężenia kreatyniny we krwi nie występuje często. Jego przyczyną może być głodówka, zanik mięśni lub stosowanie kortykosteroidów. Może wystąpić także podczas ciąży. • Stosunek stężenia mocznika do kreatyniny w surowicy krwi (prawidłowo 12 – 20) służy do oceny funkcji nerek; pozwala określić, czy występują stany kataboliczne, odwodnienie albo czy stosowana jest dieta wysokobiałkowa.

14. Kwas moczowy • główny produkt katabolizmu puryn - puryny dostarczane z dietą (ok. 300 mg/24 h) - katabolizm endogennych kwasów nukleinowych • synteza kwasu moczowego: ok. 400 mg/24 h • w nerkach kwas moczowy jest: - filtrowany w kłębuszkach nerkowych - w 98-100% resorbowany w cewkach proksymalnych krętych - następnie wydzielany do światła kanalików w części dystalnej kanalików proksymalnych - resorbowany w cewkach dystalnych • 6-12% kwasu moczowego przefiltrowanego w kłębuszkach jest wydalone z moczem.

15. Oznaczanie kwasu moczowego • Metoda chemiczna Metoda z kwasem fosforowolframowym (PTA) - wykorzystuje właściwości redukujące kwasu moczowego - PTA w środowisku alkalicznym ulega redukcji pod wpływem kwasu moczowego – powstaje barwny związek (650-700 nm) - wiele substancji interferuje w tej reakcji

16. Oznaczanie kwasu moczowego • Metoda enzymatyczna Metoda z urykazą - urykazakatalizuje utlenienie kwasu moczowego do alantoiny, czemu towarzyszy produkcja H2O2 i CO2 - guanina, ksantyna i kilka innych analogów kwasu moczowego może interferować w tej reakcji (musiałyby występować w stężeniach nie spotykanych w próbkach biologicznych) - pomiar: - w stanie równowagi (po zakończeniu inkubacji) - pomiar kinetyczny – spadek absorbancji przy 293 nm

17. Oznaczanie kwasu moczowego Metoda z urykazą sprzężona z układem peroksydazy z użyciem jednego z wielu akceptorów tlenu i wytworzeniem barwnego chromogenu: - 4-aminofenazon z substytutem fenolu = sulfonianem p-hydroksybenzenowym (reakcja Trindera = peroksydaza/fenol/4-a minoantypiryna) – 546 nm - hydrazon 3-metylo-1-benzotiazoliny (MBTH) - 2,2’-azyno-di(3-etylo-benzotiazolino)-6-siarczan (ABTS) - o-dianizydyna substancje interferujące: - kwas askorbinowy (dodaje się oksydazę askorbinianową) - bilirubina (dodaje się ferrocyjanid)

18. Oznaczanie kwasu moczowego Metoda z zastosowaniem HPLC - metoda referencyjna - chromatografia jonowymienna lub odwrotnej fazy (RP) - detektor spektrofotometryczny – 293 nm (detekcja kwasu moczowego w eluencie) - czas retencji dla kwasu moczowego: do 6 minut Proponowana metoda definitywna oznaczania kwasu moczowego to metoda rozcieńczeń izotopowych sprzężona ze spektrometrią masową (ID-MS).

19. Wartości referencyjnekwasu moczowego • Dla metod enzymatycznych: - mężczyźni: 3,5-7,2 mg/dL (0,208-0,428 mmol/L) - kobiety: 2,6-6,0 mg/dL (0,155-0,357 mmol/L) stężenie kwasu moczowego: - zwiększa się wraz z wiekiem – ok. 10% pomiędzy 20 i 60 rokiem życia - zwiększa się u kobiet po menopauzie (osiągają stężenia takie jak u mężczyzn) - w ciąży stężenie kwasu moczowego zmniejsza się w ciągu pierwszego trymestru i utrzymuje się do 24 tygodnia ciąży, kiedy zaczyna się zwiększać nawet do poziomu wyższego niż przed ciążą • Współczynnik przeliczeniowy z mg/dL na mmol/L: 0,06

20. Kwas moczowyprzydatność diagnostyczna • Nieprawidłowe stężenia kwasu moczowego Hipourykemie(stężenie kwasu moczowego w surowicy < 2 mg/dL) - leki (allopurinol, salicylany, estrogeny, fenylobutazon) - radiologiczne środki cieniujące - niewydolność wątroby - tubulopatie(zmniejszona resorpcja)

21. Kwas moczowyprzydatność diagnostyczna Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego >7 mg/dL u mężczyzn i >6 mg/dL u kobiet) - spowodowane zwiększoną syntezą kwasu moczowego - pierwotne - idiopatyczne - dziedziczne choroby metaboliczne - wtórne - zbyt duża podaż z dietą - nasilony obrót metaboliczny puryn np. w białaczkach, szpiczaku, - alkohol

22. Kwas moczowyprzydatność diagnostyczna Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego - spowodowane zmniejszonym wydalaniem kwasu moczowego - pierwotne (idiopatyczne) - wtórne - ostre i przewlekłe choroby nerek - zwiększona resorpcja w nerkach - zmniejszone wydzielanie w nerkach - zatrucie ołowiem

23. amoniak • źródła: - z glutaminy, glutaminianu, alaniny transportowanych do przewodu pokarmowego, wątroby i nerek - syntetyzowany w przewodzie pokarmowym przy udziale flory bakteryjnej jelit - wbudowywany do mocznika w cyklu mocznikowym • przy fizjologicznym pH 7,4 amoniak występuje głównie w postaci zjonizowanej nie przechodzącej przez barierę krew-mózg. W przypadku zasadowicy wzrasta stężenie postaci niezjonizowanej, przechodzącej do mózgu i przez zwiększającej ryzyko wystąpienia encefalopatii • w nerkach amoniak uczestniczy w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej oraz wpływa na zasoby sodu i potasu w organizmie

24. Oznaczanie amoniaku • Metoda pośrednia - 2 etapy Etap 1- przeprowadzenie NH4+ w NH3: techniką dyfuzji izotermalnejlub przy użyciu żywic kationowymiennych (wymiana a następnie eucja) Etap 2 - oznaczenie NH4+ - metoda Nesslera - metoda Berthelota • Metoda bezpośrednia – enzymatyczna GLDH NH4++α-ketoglutaran+ NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H2O

25. Wartości referencyjne amoniaku • Wartości referencyjne stężenia amoniakuwyrażone jako azot (N) w amoniaku - noworodki : 64-107 mmol/L (90-150 mg N/dL) - niemowlęta: 21-50 mmol/L (29-70 mg N/dL) - dorośli: 15-45 mmol/L (11-32 mg N/dL) • Stężenie amoniaku w erytrocytach: 100-330 mg N/dL • Współczynnik przeliczeniowy z mmol/L na mg N/dL: 1,41 z mg N/dL na mmol/L: 0,714

26. AmoniakPrzydatność diagnostyczna Zwiększone stężenie amoniaku we krwi Przyczyny wątrobowe: - marskość wątroby - ostra niewydolność wątroby - zapalenie wątroby - zespół Reye’a - wrodzone bloki enzymatyczne - zmniejszenie lub brak aktywności enzymów cyklu mocznikowego Czynniki pozawątrobowe przy współistniejącym uszkodzeniu wątroby: znaczne obciążenie białkiem przewodu pokarmowego, zakażenia, alkohol, hipokaliemia, zasadowica metaboliczna, zaburzone wydalanie nerkowe

27. Dziękuję za uwagę