1 / 63

荧光定量 PCR 实验原理及数据分析

荧光定量 PCR 实验原理及数据分析. Marketing Dep. Icy Wu. 内容概要. 荧光定量 PCR 的原理 荧光定量 PCR 的标记方法 荧光定量 PCR 解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南. 荧光定量 PCR 原理－－ 定义. 实时定量 PCR 技术： 利用 荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化 ，通过 Ct 值和标准曲线的关系对 起始模板 进行定量分析 与常规 PCR 技术比较： 对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析， 无法对起始模板准确定量 ，无法对扩增反应实时检测.

robin-noble
Download Presentation

荧光定量 PCR 实验原理及数据分析

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 荧光定量PCR实验原理及数据分析 Marketing Dep. Icy Wu

  2. 内容概要 • 荧光定量PCR的原理 • 荧光定量PCR的标记方法 • 荧光定量PCR解析方法 • 荧光定量实验流程及注意事项 • 生工荧光定量产品选择指南 www.sangon.com

  3. 荧光定量PCR原理－－定义 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 www.sangon.com

  4. 荧光定量PCR原理－－常用名词概念 • 扩增曲线 • 荧光阈值 • Ct值 www.sangon.com 4

  5. 荧光定量PCR原理－－扩增曲线 荧光基团 荧光检测元件 平台期 Lg－liner phase Rn（荧光强度） Baseline Cycle（循环数） www.sangon.com 5

  6. 荧光定量PCR原理－－荧光阈值 平台期 • 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） • 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 • 手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 • 真正的信号:荧光信号超过阈值 Lg－liner phase Rn（荧光强度） Threshold Baseline Cycle（循环数） www.sangon.com 6

  7. 荧光定量PCR原理－－Ct值 • Ct值的定义： • PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Rn（荧光强度） Ct value Cycle（循环数） www.sangon.com 7

  8. 荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性 纵轴：荧光信号量 横轴：PCR反映循环数 • Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性 www.sangon.com 8

  9. 荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理 理想的PCR反应 Xn＝X0 2n * n：扩增循环数 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量 www.sangon.com 9

  10. 荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理 非理想的PCR反应 Xn＝X0（1＋En）n * n：扩增循环数 En：扩增效率 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量 www.sangon.com 10

  11. 荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理 在扩增产物达到荧光阈值时 XCt＝X0 * （1＋En）Ct＝M（1） XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M 方程式（1）两边同取对数得： Log2M＝Log2X0*（1＋En）Ct（2） 整理方程式（2）： Log2X0= Log2M- Ct Log2（1＋En） www.sangon.com 11

  12. 荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系 Sample Ck 102 Ck 104 • 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。 • Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。 Cycle number Lg of DNA concentration www.sangon.com 12

  13. 荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认 • 线性关系、扩增效率确认 • 相关系数（R2）：大于0.98 • 标准曲线斜率：-3 － -3.5 • PCR扩增效率（E）：0.9-1.2 • 检测灵敏度确认 • 35Cycles内可得到好的定量结果 • 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增 • No template control确认 • 35 Cycles内无引物二聚体产生 www.sangon.com 13

  14. 内容概要 • 荧光定量PCR的原理 • 荧光定量PCR的标记方法 • 荧光定量PCR解析方法 • 荧光定量实验流程及注意事项 • 生工荧光定量产品选择指南 www.sangon.com 14

  15. 常用荧光定量标记方法 • 非特异性荧光标记 • SYBR Green I • 特异性荧光标记 • TaqMan Probe www.sangon.com 15

  16. SYBR Green I 染料法－－原理 • SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 SYBR Green I www.sangon.com 16

  17. SYBR Green I 染料法－－作用机理 热变性 引物退火 延伸反应 www.sangon.com 17

  18. SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点 • 问题点： • SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 • 关键点： • 设计合适引物，防止非特异性扩增！ www.sangon.com 18

  19. SYBR Green I 染料法－－融解曲线 原始图谱 对数图谱 将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) www.sangon.com 19

  20. SYBR Green I 染料法－－融解曲线 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光： 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光： 定量不准确 www.sangon.com 20

  21. SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点 缺 点 • 使用方便，不必设计复杂探针 • 具有价格优势 • 无模板特异性 • 对引物特异性要求较高 • 不能进行多重定量 • 灵敏度相对较低 www.sangon.com 21

  22. Taqman 探针法－－原理 • 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 • 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) • 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 • Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 www.sangon.com 22

  23. Taqman 探针法－－工作机理 探针 热变性 淬灭基团 引物 报告基团 R 引物和探针与模板退火 DNA聚合酶 探针 R R 延伸反应 R www.sangon.com 23

  24. Taqman 探针法－－PCR体系的建立 • 引物、探针的设计： • 探针Tm为68-70℃, <30 bp, 5’不能有G, G可能会淬灭荧光素 • 引物尽量靠近探针, 扩增片段<400 bp, 引物Tm为59-60℃ • 反应参数的确定： • 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S （Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 • 优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 • 引物浓度：100-900nM • 探针浓度：50-300nM • 其他与常规PCR相同 www.sangon.com 24

  25. Taqman 探针法－－优缺点 优 点 缺 点 • 高度特异性 • 重复性好 • 灵敏度高 • 可进行多重定量 • 只适合一个特定的目标 • 委托公司标记，价格较高 • 不易找到本底低的探针 www.sangon.com 25

  26. 实时荧光定量PCR分类－－分子信标 环 • 标记荧光的发夹探针 • 环与目标序列互补 • 茎由互补配对序列组成 茎 荧光素 淬灭剂 www.sangon.com 26

  27. FRET 实时荧光定量PCR分类－－分子信标 www.sangon.com 27

  28. 实时荧光定量PCR分类－－分子信标 优 点 缺 点 • 高特异性：对目标序列 • 检测SNP最灵敏的试剂之一 • 荧光背景低 • 只能用于一个特定目标 • 设计困难 • 价格比较高 www.sangon.com 28

  29. 几种荧光定量PCR方法的应用比较 www.sangon.com 29

  30. 荧光定量PCR技术的主要应用 • 定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 • 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等 • 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等 www.sangon.com 30

  31. 内容概要 • 荧光定量PCR的原理 • 荧光定量PCR的标记方法 • 荧光定量PCR解析方法 • 荧光定量实验流程及注意事项 • 生工荧光定量产品选择指南 www.sangon.com 31

  32. 荧光定量PCR的解析方法 • 绝对定量解析方法 • 相对定量解析方法 www.sangon.com 32

  33. Sample 25 绝对定量的定义 • Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 • 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 www.sangon.com 33

  34. 绝对定量分析几要素 • 一个目的基因——即需要确定其量值的核酸序列。 • 一组标准样本——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 • 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 • 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。 www.sangon.com 34

  35. 绝对定量质粒标准品的制备 基因组DNA 目的基因 PCR 目的基因 目的基因克隆 目的基因 目的基因 质粒 质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用 www.sangon.com 35

  36. 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 • 倍比梯度稀释方法： • 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii • 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii • 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv • 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v • 拷贝数的计算： • 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 • 样本分子量=碱基数×324 • 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 www.sangon.com 36

  37. 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 • 标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、 103；2个重复；设阴性空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。 www.sangon.com 37

  38. 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 www.sangon.com 38

  39. 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978 扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.29 -1 =2.01-1 =1.01 相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 www.sangon.com 39

  40. 20.5-40.33 X= =6.03 -3.29 绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies www.sangon.com 40

  41. 荧光定量PCR的解析方法 • 绝对定量解析方法 • 相对定量解析方法 www.sangon.com 41

  42. Sample B Sample A 细胞起始数相同 RNA提取效率相同 目的基因扩增效率相同 相对定量的必要性 实际目的基因表达量分析 www.sangon.com 42

  43. 相对定量分析方法 • 比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！ • 关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ www.sangon.com 43

  44. 相对定量分析几要素 • 一个参照样本 • 一个或一个以上的未知样本 • 一个目的基因 • 管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 • 重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性 • 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可 • 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要） • 一组标准样本（有些分析方法不需要） www.sangon.com 44

  45. 6 β-Actin 5 GAPDH 4 3 实验值 β-2-microglobulin 2 1 HPRT 0 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 相对定量分析－－管家基因筛选 • 管家基因 • 维持细胞基本代谢活动所必须的基因， • 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 • 筛选方法 • 根据文献提供 • 通过具体实验筛选 P P O P www.sangon.com 45

  46. 相对定量分析－－两种常用的分析方法 • 双标准曲线法 • 2 -△△Ct法 www.sangon.com 46

  47. 相对定量分析－－双标曲线法 • 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 • 公式： 目的基因定量结果 校正值= 管家基因定量结果 待测样品的校正值 相对值= 对照样品的校正值 www.sangon.com 47

  48. 相对定量分析－－双标曲线法 实验数据 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 www.sangon.com 48

  49. 相对定量分析－－2－△△Ct法 XT 是目标分子达到设定的阈值时的分子数 RT是内参分子达到设定的阈值时的分子数 假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或 最后用任一样本 q 的 XN除以参照因子（calibrator，cb）的 XN得到： 对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是： www.sangon.com 49

  50. 待测组内参基因 平均Ct值 对照组目的基因 平均Ct值 对照组内参基因 平均Ct值 待测组目的基因平均Ct值 － － － 相对定量分析－－2－△△Ct法 • 公式： － F = 2 • 优点：无需作标准曲线 • 缺点：假定扩增效率为 100 %； • 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； • 实验条件优化较为复杂。 • 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 www.sangon.com 50

More Related