Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tópicos 1. DNA 2. PCR • Alvos • Denaturação • Primers • Anelamento • Ciclos • Requerimentos

DNA DNA é um ácido nucléico composto de duas cadeias antiparalelas complementares. Os nucleotídeos são compostos de um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada

DNA • Acúcar do DNA • Ácido Desoxirribonucleico • Açúcar do RNA • Ácido Ribonucleico

DNA O DNA tem quatro bases nitrogenadas. • Duas são chamadas purinas • Adenina ( A ), Guanina ( G ) • Duas são pirimidinas • Citosina ( C ), Timina ( T )

DNA Essas quatro bases são ligadas em um padrão repetitivo por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas A ligação de duas cadeias complementares é chamada de HIBRIDIZAÇÃO.

DNA Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a estrutura do DNA. Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de duas pontes de hidrogênio. Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através de três pontes de hidrogênio.

DNA Examplo de padrão de ligação. • Padrão primário CCGAATGGGATGC GGCTTACCCTACG • Padrão complementar

DNA Molecule Adenina Timina Guanina Citosina

PCR PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.

OS Alvos do PCR Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.

PCR Targets O número de bases nos alvos pode variar. TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.

PCR - Desnaturação A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.

PCR Primers Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da seuqência-alvo.

PCR Primers Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.

PCR Primers TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .> e <. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT

PCR Primers OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.

PCR - Anelamento O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.

PCR Taq DNA Polimerase O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

PCR Taq DNA Polimerase Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de MG, a altas temperaturas.

PCR Ciclos

PCR Cycles

PCR Ciclos • Desnaturação: 94°- 95°C • Anelamento: 55°- 65°C • Extensão: 72° • Número de ciclos: 25-40

PCR Ciclos

PCR Ciclos Número de cópias da Região alvo de DNA A = 2n n = número de ciclos

PCR Requerimentos • Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM • Tampão: pH 8.3-8.8 • dNTPs: 20-200µM • Primers: 0.1-0.5µM • DNA Polimerase: 1-2.5 units • DNA Alvo:  1 µg

Extração de DNA de células sanguíneas Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de Não remover a faixa de células brancas.

Extração de DNA de células sanguíneas Extrair cuidadosamente 200ul da região de células brancas E separar em tubos identificados

Extração de DNA de células sanguíneas Adicionar Protease a Cada tubo Adicionar Tampão de Lise em cada tubo

Extração de DNA de células sanguíneas Realizar Homogeneização Criteriosa do material

Extração de DNA de células sanguíneas Incubar os tubos A 56C por pelo Menos 10min.

Extração de DNA de células sanguíneas Centrifugar os tubos para retirar quaisquer grumos Adicionar etanol para lavagem e centrifugar de novo.

Extração de DNA de células sanguíneas Adicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .

Extração de DNA de células sanguíneas Tubo com coluna A coluna vai ser retirada e adaptada em outro tubo no qual será feita a eluição Coluna. Esse eluato (flow through) será Descartado.

Extração de DNA de células sanguíneas A coluna será colocada em um novo tubo, aonde será Lavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquer Moléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.

Extração de DNA de células sanguíneas A coluna com o tubo é então centrifugada Mais uma vez, para remover excesso de Tampão de Lavagem. O próximo passo é adicionar Tampão de Eluição • Incuba-se por 30 minutos a 25C • O eluato da coluna é então guardado, pois agora esse contém o DNA Alvo.

Extração de DNA de células sanguíneas • Então pode-se preparar o mix de PCR. • Mix de PCR • 10x Buffer - 10 µl • MgCl - 6 µl • dNTPs- 0.8 µl • Primer forward - 2 µl • Primer reverse - 2 µl • Taq polimerase - 0.5 µl • H2O estéril - 73.7 µl

Extração de DNA de células sanguíneas Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos Específicos e colocar em termociclador.

Extração de DNA de células sanguíneas Análise do produto de PCR.

Bibliografia • Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/ forensci_PCR.htm.l • Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html • Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and Tom Wiggers.

Bibliografia • Ronald H. Holton, Ph.D.: • Molecular Diagnostics in the Clinical Laboratory • Molecular Biology in the Clinical Laboratory • Molecular Pathology: Basic Methodologies and Clinical Applications • Expanding applications of PCR, by Peter Gwynne and Guy Page

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