DNA RECOMBINANTE E INGIENIER Í A GEN É TICA

1. DNA RECOMBINANTE E INGIENIERÍA GENÉTICA

2. INGENIERÍA GENÉTICA MANIPULACIÓN DEL DNA DE LOS ORGANISMOS VIVOS 1) INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS). 2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.

3. PIEDRAS ANGULARES DE LA INGIENIERÍA GENÉTICA • CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS • DE cDNA Y GENÓMICAS • DESCUBRIMEINTO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN) • DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓN • DE POLIMERIZACIÓN DE CADENA O • PCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)

4. Técnicas de DNA Recombinante

5. El problema: ¿Qué material genético vamos a manipular y cómo lo vamos a hacer?

7. ANALISIS DE GENES • Aislar secuencias de DNA • Obtener múltiples copias de ellos TECNICAS • Clonamiento Molecular • PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Se requiere:

8. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped *

9. Enzimas de Restricción

10. DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Sitio de corte

11. ENZIMAS de RESTRICCION ES Sitios de corte de endonucleasas de restricción Sitio de corte de enzimas de restricción Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima

12. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped

13. Características básicas de un vector de • clonamiento • Origen de replicación autónomo • Gen marcador de selección • Sitios únicos de restricción

14. Componentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.coli codifica proteína de resistencia a ampicilina Región de inserción de DNA Exógeno Origen de replicación Caja de clonaje múltiple

15. ¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ? 1ª división celular 2ª división celular

16. TIPOS DE VECTORES kpb inserto Plasmidios 3-5 bacteriofagos 15 BACS 300 YACS 2000

17. CLONAMIENTO EN PLASMIDIO Sitio de corte Sitio de corte DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII EcoRI PvuII Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII

18. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped

19. Unión de fragmentos de restricción que poseen extremos cohesivos Fragmentos de DNA genómico b + c

20. CLONAMIENTO EN PLASMIDIO Sitio de corte Sitio de corte DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII EcoRI PvuII Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII

21. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped

22. PROPAGACION EN CELULA HUESPED

23. RESUMEN DE CLONAMIENTO Enzimas de restricción DNA Ligasa Vector Célula huésped

24. CLONES que contienen diferentes fragmentos del genoma = GENOTECA

25. GENOTECAS O LIBRERÍAS CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNA Y DE DNA GENÓMICO USO DE VECTORES -PLASMIDIOS -DNAs DE FAGOS -OTROS (BACs, COSMIDIOS, YACs, ETC).

27. Genoteca de cDNA • Obtención : • Clonamiento de cDNA obtenido mediante transcripción reversa de mRNA total.

32. vectores ligación + transformación

33. Genoteca de DNA genómico Obtención : 1.Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción 2. Clonamiento de fragmentos en vectores

35. ¿Cómo aislar un fragmento de DNAde interés? Aislamiento de un clon -Uso de sondas radiactivas - PCR

36. Identificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADAS

37. Clonamiento por PCR

39. libreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

40. Combinación de la transcripción reversa con PCR RT-PCR

42. Cloning by RT-PCR TTTTTTT PCR cDNA Corte con enzimas de restricción y ligación a un plasmidio

43. libreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

44. SECUENCIACION DEL DNA

45. Estudio de la función de un gen Vectores de expresión

46. Vector de expresión en bacterias

48. Vectores de expresión en eucariotes

49. FUNCIÓN DE UN GEN • Herramientas de Estudio: • Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce. • Animales transgénicos y knock out.