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Práctica Enzimas de Restricción

Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción. Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio.

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Práctica Enzimas de Restricción

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Presentation Transcript

  1. Práctica Enzimas de Restricción

  2. Enzimas de restricción • Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias • Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio • ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio

  3. Enzimas de restricción • Se han identificado cientos • La mayoría reconocen y cortan secuencias palindrómicas • Muchas dejan “puntas pegajosas” • Se pueden hacer cortes muy precisos del ADN al escoger la enzima • Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria

  4. Palíndrome • oso • radar • reconocer • rotor • salas • seres • somos • sometemos • oro • ala • ojo

  5. Secuencia palindrómica en biología • Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras 5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5'

  6. Algunas enzimas usadas comúnmente Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTT Sac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G

  7. Uso de enzimas de restricción • La actividad depende de condiciones precisas: pH Temperatura Concentración de sales Iones • Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas: 3-5 u/ug de ADN genómico 1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul

  8. Tipos corte

  9. Utilidad para ADN recombinante

  10. Marcador de peso molecular • Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel • A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción • Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas • O la escalera de 1kb

  11. Plásmidos en gel

  12. Electroforesis de plásmidos • Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones • No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado. • Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza

  13. Digestión plásmidos pUWL201/EcoRI pGEM-T/EcoRI pUWL201 pGEM-T Número bandas= número de sitios de restricción

  14. Digestión ADN genómico

  15. Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis

  16. Deleción en FQ Fibrosis quística Recesiva Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos Degradada en RE, no llega a membrana celular

  17. Diagnóstico por sitios de restricción

  18. Mutación Hemocromatosis Mutación: Cys282Tyr

  19. Mutación Hemocromatosis Mutación: His63Asp

  20. http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.htmlhttp://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.html

  21. Lambda cortado con EcoRI 5 cortes

  22. Lambda cortado con Eco RI 6 fragmentos

  23. Práctica • Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción

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