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1. I recettori a sette domini transmembrana Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web: www.unipv.it/tslmra22

2. Forme di Signaling Cellulare (A) ENDOCRINO (B) PARACRINO cellula endocrina recettore cellula segnalatrice ormone cellule bersaglio mediatore locale Flusso sanguigno cellula bersaglio (C) NEUROCRINO (D) CONTATTO-DIPENDENTE cellula segnalatrice cellula bersaglio sinapsi neurone assone cellula bersaglio corpo cellulare neurotrasmetttore messaggero legato alla membrana (A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine sono secreti nel flusso sanguigno e possono essere distribuiti all’intero organismo. (B) I messaggeri paracrini sono rilasciati dalle cellule nel mezzo extracellulare e possono diffondere e agire localmente. (C) I segnali nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule bersaglio remote. (D) Il signaling contatto-dipendente richiede che le cellule siano a contatto l’una con l’altra membrana contro membrana. Le differenze cruciali tra le varie modalità riguardano la velocità e la selettività con cui I segnali sono trasmessi alle cellule bersaglio.

3. fattore di crescita ormone citochina recettore tirosin chinasi recettore per le citochine recettore accoppiato a proteina G via dell’AMPc via dell’IP3 via del PI 3-kinasi via delle MAP kinasi via del JAK-STAT Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice

4. recettore G proteina i q s t effettore canale enzima messaggero intracellulare Ca2+ cAMP Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G

5. Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di membrana Lipide di membrana Idrofobico + Idrofilico = Anfipatico Glicerofosfolipide Sfingomielina Glicosfingolipide Colesterolo Diacilglicerolo Ceramide Ceramide Anelli idrocarburici Alcool fosforilato Fosforilcolina Residui glucidici Gruppo OH di C3 Glicerofosfolipide Glicosfingolipide Colesterolo

6. Lipidi di Membrana semplice organizzazione di molecole anfipatiche idrofilico idrofobico Lipidi di Membrana Sezione di un bilayer di glicerofosfolipidi

7. Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana

8. Proteine Acilate e Prenilate Acido palmitico acido grasso legato mediante legame estere a una Cys; aggiunto in fase post-traslazionale Esempi: recettore per l’insulina recettore beta-adrenergico rodopsina Acido miristico acido grasso legato mediante legame amidico a una Gly; aggiunto in fase co-traslazionale Esempio: subunutà a di proteina G (membrana plasmatica) Isoprenoide (farnesil;geranilgeranil) Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una Cys vicina all’estremità C-terminale; aggiunto in fase post-traslazionale Esempio: subunutà g di proteina G (membrana plasmatica)

9. siti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell. ancoraggio lipidico citosol siti di fosforilazione Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.

10. Recettori Accoppiati a Proteine G 1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad es. rodopsina) 2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel genoma. (di molti di essi non si conosce ancora il ligando) 3. I singoli recettori rispondono a: un neurotrasmettitore come la serotonina o la dopamina, una piccola proteina (8-40 amminoacidi, un “peptide”) come le endorfine uno stimolo olfattorio la luce, nell’occhio

11. siti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell. ancoraggio lipidico dominio transmembrana citosol siti di fosforilazione Struttura Generale dei Recettori a 7 DT Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono: domini transmembrana ad a-elica, ancoraggio ai lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti di fosforilazione citosolici che ne regolano l’attività, e siti di glicosilazione extracellulare che permettono l’interazione con molecole extracellulari e altre cellule.

12. Rodopsina La Rodopsina è stato il primo membro della famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua struttura determinata mediante cristallografia ai raggi-x PDB 1F88

13. Varie proteine interagiscono con I GPCR o Recettori a 7-DT per modularne l’attività Gli effetti di queste interazioni includono alterata affinità per il ligando, dimerizzazione del recettore che può aumentarne o alterarne l’attività, alterata localizzazione del recettore, ecc.

14. RUOLO DELLA b-ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE legame del messaggero fosforilazione del recettore interazione con b-ARR associazione con CLATRINA Formaazione della vescicola endocitosi 1.Dopo un certo tempo che si è stabilito il legame dell’agonista al GPCR, una kinasi (GRK) fosforila alcuni residui aminoacidici intracellulari del recettore; 2.La fosforilazione porta a un disaccoppiamento del GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al reclutamento della b-arrestina; 3.La b-arrestina a sua volta recluta molecole di clatrina; 4.Le molecole di clatrina favoriscono la formazione di una cavità da cui originerà la vescicola 5. La successiva endocitosi della vescicola provocherà l’internalizzazione del recettore.

15. Recettore di classe A Recettore di classe B Le Proprietà dell’Internalizzazione definiscono due classi di GPCRs. Nel caso dei recettori di classe A (b2-Adre), l’interazione b-arrestina–GPCR è transitoria, e la b-arrestina non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i recettori di classe B (Vaso2), l’interazione b-arrestina–GPCR è più stabile, e recettore e b–arrestina co-localizzano negli endosomi.

16. Traffico Cellulare della arr2-GFP con i Recettori 2AR (adre) e V2R (vasopr) adren • Assenza di agonista, la arr2-GFP era omogeneamente distribuita nel citoplasma delle cellule che esprimevano 2AR o V2R. (0 min) • Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida redistribuzione dal citosol alla membrana plasmatica. (2 min) • Una esposizione piu prolungata all’ agonista produceva una marcata differenza nel traffico della arr2-GFP (15 min): • 2AR : rimaneva nella membrana plasmatica (A) • V2R : nell’arco di 2-3 min, finisce nellevescicole endocitotiche (B) vasopr • Cellule HEK-293 •  Co-transfettate con un plasmide contenente il cDNA per arr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore • Per visualizzare la arr2-GFP fluorescente in cellule prima e dopo il trattamento con agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)

17. Colocalizzazione della arr2-GFP con i Recettori 2AR e V2R internalizzati adren • I recettori 2AR e V2R reclutano arrestin con un meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma poi c’è divergenza. Il complesso arrestin- 2AR si dissocia a livello della membrana. arrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole endocitotiche. vasopr • Cellule HEK-293 •  Co-transfettate con arr2-GFP e ciascun recettore • Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo che marca I recettori • trattate per 15 min a 37C con l’agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP) • visualizzazione al confocale del recettore (rosso) e della arr2-GFP (verde) nelle stesse cellule. Colocalizzazione (giallo) del recettore con la arr2-GFP • V2R : estesa colocalizzazione • 2AR : nessuna colocalizzazione

18. Quanto lontano? probabilmente <1 mm Quanto veloce? da 100 ms a 10 s Il neurotrasmettitore o l’ormone si lega al recettore Attiva una G proteina Effettore: enzima o canale esterno interno a a g g GDP + Pi b b Risposta GTP Recettori accoppiati a proteine G