Dudas denucci@dglnet.br Archivo Analytical Methodologies spanish v97 Sitio gdenucci

1. Dudas denucci@dglnet.com.br Archivo Analytical Methodologies spanish v97.ppt Sitio www.gdenucci.com

3. El uso de LC-MS/MS en Estudios de Bioequivalencia Gilberto De Nucci Unidad Analítica Cartesius Universidad de São Paulo, Brasil denucci@dglnet.com.br

4. Tópicos • La bioequivalencia • La espectrometría de masas • La opción por un standard interno • Los métodos de ionización • La preparación de las muestras • El experimento de supresión iónica • Ejemplos prácticos • Conclusión

5. Bioequivalencia Dos formulaciones de la misma forma farmaceutica producen perfiles de biodisponibilidad equivalentes

6. La biodisponibilidad puede ser medida a travez de la medida de: • Concentración del principio activo o metabolito(s) en fluidos biológicos en función del tiempo. • Excreción urinaria del principio activo o metabolito(s) em función del tiempo. • Cualquier efecto farmacológico apropiado.

7. Parámetros farmacocinéticos 8 6 4 2 0 Cmax Concentración tmax 0 3 6 9 12 Horas

8. Parámetros farmacocinéticos 8 6 4 2 0 Concentración AUC 0-12h 0 3 6 9 12 Horas

9. Qué es la espectrometria de masas? • Efectua la medida de masas (relación masa/carga – m/z) • Técnica analítica para: • identificar de compuestos desconocidos • elucidar estructuras y propiedades químicas • cuantificación substancias químicas • Apropiado para detección de concentraciones muy pequeñas (tipicamente 10-12 - 10-15 moles)

10. Cómo el espectrómetro de masas funciona?

11. La disposición del espectrómetro de masas de triple cuadrupolo

12. Espectrometria de masas - Métodos de ionización • Impacto de Electrones (EI) • Ionización Química (CI) • Ionización a Presión Atmosférica (API) • Ionización por ElectroSpray (ESI) • Ionización Química a Presión Atmosférica (APcI) • Ionización por desorción em matriz assistida por rayos laser (MALDI)

13. Por qué usar API-MS? • Cubre una amplia gama de peso molecular • Compatible con gran parte de los compuestos conocidos • Diversos tipos de interfaces pueden ser utilizadas (inyección en flujo, HPLC, eletroforesis capilar) • Robusto y fácil de usar

14. Tipos de ionización a presión atmosférica (API-MS) • Electrospray (ESI): utiliza campos eléctricos para generar gotas cargadas que se tansforman en spray. Puede ser positivo (ES+) o negativo (ES-). • APcI: donde el disolvente actua como gas ionizante • APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization): Una Lampara de Kriptonio produce luz UV que ioniza los analitos o dopantes con subsecuente reacción en fase de gas

15. Requisitos para los standard interno (I.S.) • Estructura química similar (Análogos) • el analito y el I.S. devem poseer los mismos grupos funcionales • atención especial a la fase de extracción • las condiciones de ionización no pueden ser muuy diferentes • Isótopos deuterados • Se trata del analito marcado isotopicamente • Ni siempre está disponible comercialmente

16. Tipos de extracción de las muestras • Líquido/Líquido • dos fases (acuosa/orgánica) • Más rápida • Más barata • Precipitación de proteinas • Muy simple • Rápida • Muestras más “sucias” • SPE (Extracción en fase sólida) • Cartuchos de extracción • Facilidad para la autmotización • Más cara

17. Procedimiento típico para las extraccionesLíquido/Líquido

19. Procedimiento típico para las extracciones en fase sólida (SPE) • Adicione las muestras en los tubos de vidrio; • Coloque la cantidad de I.S. e agite en vortex por 10 seg.; • Aplique las muestras a los cartuchos de SPE (previamente pre-condicionados con metanol y agua), usando una presión positiva; • Lave los cartuchos (en general usando água); • Aplicar presión positva para asegurar que los cartuchos queden secos; • El extracto é posteriormente eluido de los cartuchos usando un eluente apropiado y recogerlo en tubos de vidrio; • Resuspender com una solución apropiada e transferirlas en los viales de HPLC;

20. Liquido/Liquido Fluoxetina Fluconazol Captopril Omeprazol Paroxetina Diazepam Bromazepam Midazolam Nimodipino Amlodipina SPE Cefalexina Cefaclor Amoxicilina Didanosina Acyclovir Losartan Enalapril Lisinopril Algunos ejemplos de uso en estudios de bioequivalenccia • Precipitación de proteinas • Metil-DOPA

21. Supresion iónica • Supresión de la señal en el espectrómetro de masas • Causada por cualquier interferencia (e.g. sales, proteinas, etc.) • Extracción no específica • Los efectos de la preparación de muestras en el proceso de ionización devem ser evaluadas

22. Experimento de supresión iónicaMontaje

23. Experimento de supresión iónica • Bomba de infusión: una conc. standard de una mezcla de analito/IS (por ejemplo 50 ug/mL a 50 uL.min) • Bomba de HPLC: el flujo de fase movil especificado para el ensayo • Extrair e inyectar en el sistem así dispuesto una muestra no contaminada • Observe lo que pasa con la señal (línea de base)

24. 100 MRM of 2 Channels ES+ % 247 > 204.2 -15 100 237 > 194.2 % -15 Time 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Experimento de supresión iónicaResultado típico

25. 2.32 100 MRM of 2 Channels ES+ % 247 > 204.2 -15 2.37 100 237 > 194.2 % -15 Time 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Experimento de supresión iónicaCromatograma de la muestra

26. Estudios de bioequivalencia: Ejemplos prácticos

27. Sistemas de LC-MS/MS de la Unidad Analítica Cartesius • Micromass • Quattro II (desde 1997) • Quattro LC (desde 2000) • Quattro Ultima (desde 2001) • Quattro Micro (desde 2003) • Sciex/Applied Biosystems • API 2000 (desde 2002)

28. Sistemas de LC-MS/MS de la Unidad de Investigación Galeno • Micromass • Q-TOF Ultima (desde 2002) • Sciex/Applied Biosystems (desde 2003) • 3 equipos API 4000 • 1 equipo API 3000

29. Estructuras químicasCaptopril y Enalapril (IS)

30. Método analítico para determinación de Captopril total • Extracción:Líquido/Líquido usando éter/diclorometano (70/30, v/v) con tratamiento anterior usando ditiotreitol • Columna analítica:Jones Genesis C18, 4um (150x4.6 mm id) • Fase movil: Isocratica [agua/metanol (40/60; v/v) + 5 mM acetato de amonio + 13 mM ácido trifuoroacético] • Flujo: 1.0 mL/min • Standard interno: Enalapril • Tiempos de retención: • 2.6 min (Captopril – MRM 217.2 -> 115.9) • 3.6 min. (I.S. - Enalapril – MRM 377.4 -> 234.0) • Tiempo total de HPLC:6.0 min

31. Método analítico para determinación de Captopril total • Condiciones MS: ES+ • Sistema: Micromass Quattro II • LLOQ: 0.0100 µg/ml • CV% = 12.9% • Accuracy = 99.3% • Inter Batch Precision (CV%) • LLOQ = 11.1% • Arriba del LLOQ = < 6.6% • Inter Batch Accuracy (%) • LLOQ = 97.1% • Arriba del LLOQ > 92.7%

32. Captopril 10 ng/mL in plasma 3.65 100 8533 MRM of 2 Channels ES+ 377.4 > 234 % 0 2.56 100 275 MRM of 2 Channels ES+ 217.2 > 115.9 % 0 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Cromatograma del “LOQ”

33. Estructuras químicasMidazolam, 1-OH Mmidazolam y Alprazolam (IS)

34. Método analítico para determinación de Midazolam/1-OH Midazolam • Extracción:Líquido/Líquido usando eter/diclorometano (70/30, v/v) • Columna analítica:Alltech Prevail C8, 5um (150x4.6 mm id) • Fase movil: Isocratica [agua/metanol (35/65; v/v) + 12 mM ácido fórmico] • Flujo: 1.5 mL/min • Standard interno: Alprazolam • Tiempo de retención: • 2.0 min (Midazolam – MRM 326.2 -> 281.4) • 2.2 min (1-OH Midazolam – MRM 342.3 -> 203.3) • 3.3 min. (I.S. - Alprazolam – MRM 309.3 -> 281.4) • Tiemppo total de HPLC:4.5 min

35. Método analítico para determinación de Midazolam/1-OH Midazolam • Condiciones de MS: ES+ • Sistema: Micromass Quattro Ultima • LLOQ: 0.500 ng/ml (para ambos analitos) • CV% = 12.7% (Parent); 18.7% (Metabolito) • Accuracy = 85.9% (Parent); 98.9% (Metabolito) • Inter Batch Precision (CV%) • LLOQ = 10.9% (Parent); 15.9 (Metabolito) • Arriba del LLOQ = < 6.0% (Parent); <9.5% (Metabolito) • Inter Batch Accuracy (%) • LLOQ = 111.3% (Parent); 103.2 (Metabolito) • Arriba del LLOQ > 96.4% (Parent); >92.1%

36. QL-Midazolam 0.50 ng/mL + 1-OH-Midazolam in plasma MRM of 3 Channels ES+ 2.19;233 100 342.3 > 203.3 % -15 MRM of 3 Channels ES+ 100 2.00;1592 326.2 > 291.4 % -15 3.30 MRM of 3 Channels ES+ 100 21577 309.3 > 281.4 % Time -15 1.00 2.00 3.00 4.00 Cromatograma del “LOQ”

37. Estructuras químicasPantoprazol y Lansoprazol (IS)

38. Método analítico para determinación de Pantoprazol • Sample Extraction:Líquido/Líquido usando eter/diclorometano (70/30, v/v) • Columna analítica:Jones Genesis C8, 4um (150x4.6 mm id) • Fase movil: Isocratica [acetonitrilo/agua/metanol (57/25/18; v/v) + 20 mM acetato de amonio + 10 mM ácido acético] • Flujo: 0.7 mL/min • Standard interno: Lansoprazol • Tiempos de retención: • 3.4 min (Pantoprazole – MRM 383.4 -> 199.6) • 3.7 min. (I.S. - Lansoprazole – MRM 369.9 -> 251.6) • Tiempo total de HPLC:4.5 min

39. Método analítico para determinación de Pantoprazol • Condiciones de MS: ES+ • Sistema: Micromass Quattro II • LLOQ: 5.00 ng/ml • CV% = 13.9% • Accuracy = 93.3% • Inter Batch Precision (CV%) • LLOQ = 14.0% • Arriba del LLOQ = < 4.7% • Inter Batch Accuracy (%) • LLOQ = 89.4% • Arriba del LLOQ > 97.1%

40. MRM of 2 Channels ES+ Pantoprazol 5.00ng/mL in Plasma extr 369.95 > 251.58 3.67;42887 100 % 0 MRM of 2 Channels ES+ 3.40;273 100 383.84 > 199.63 % 0 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 Cromatograma del “LOQ”

41. Estructuras químicasHidroclorotiazida y Clortalidona (IS)

42. Método analítico para determinación de Hidroclorotiazida • Extracción:Líquido/Líquido usando eter/diclorometano (60/40, v/v) • Columna:Jones Genesis C18, 4um (100x2.1 mm id) • Fase movil: Isocratico [acetonitrilo/agua (90/10; v/v) + 2.35 mM hidróxido de amonio] • Flujo: 0.2 mL/min • Standard interno: Chlorthalidone • Tiempo de retención: • 1.6 min (Hydrochlorothiazide – MRM 295.8 -> 204.9) • 1.6 min. (I.S. - Chlorthalidone – MRM 336.8 -> 189.8) • Tiempo total de HPLC:3.0 min

43. Método analítico para determinación de Hidroclorotiazida • Condiciones de MS: ES- • Sistema: API 2000 • LLOQ: 1.00 ng/ml • CV% = 16.8% • Accuracy = 100.4% • Inter Batch Precision (CV%) • LLOQ = 17.1% • Arriba del LLOQ = < 6.9% • Inter Batch Accuracy (%) • LLOQ = 103.1% • Arriba del LLOQ > 98.0%

44. "LOQ - Hidrochlorothiazide 1.00 ng/mL in plasma extr." 1.31 900 800 700 600 Mass(es): "295.8/204.9 amu" 500 Intensity, cps 400 300 200 100 0 1.6e4 1.32 1.4e4 1.2e4 1.0e4 Intensity, cps Mass(es): "336.8/189.8 amu" 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Time, min Cromatograma del “LOQ”

45. Ejemplo de cómo el experimento de supresion iónica pude ayudar a mejorar um método já existente

46. Estructuras químicasEnalapril/Enalaprilato y Enalapril/Enalaprilato-fenil-d5 (IS)

47. Mix Enalapril/Enalaprilat 0.5ng/mL in plasma extr. 100 3.73;13364 MRM of 4 Channels ES+ 382.7 > 308.44 % -15 100 3.79 MRM of 4 Channels ES+ 340 377.36 > 303.4 % -15 100 2.45;21605 MRM of 4 Channels ES+ 354.65 > 211.4 % -15 100 2.48;578 MRM of 4 Channels ES+ 349.5 > 206.3 % -15 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Cromatograma del “LOQ” – Método antiguo

48. Experimento de supresión iónicaSupresión posterior a la salida del pico

49. Cambiando totalmente las condiciones …

50. CH3CN/H2O (60/40; v/v) + 10 mM ácido fórmico Jones C8 (100 x 2.1 mm id) Flujo: 0.2 mL/min. Tiempos totales de HPLC menoras y pérdida de la supresión posterior a la salida del pico