Ciclo Celular

1. Ciclo Celular El ciclo celular es una serie ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la producción de dos células, cada una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la célula madre.

2. El ciclo celular es una serie ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la producción de dos células, cada una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la célula madre.

3. Objetivos • Mostrar como la unión de varios estudios independientes generó el conocimiento base sobre el ciclo celular. • Presentar diferentes técnicas moleculares utilizadas para la disección de los mecanismos de control de un proceso fisiológico, en este caso el ciclo celular. • Mostrar el conocimiento actual la regulación del ciclo celular en plantas. • Transducción de señales de los principales reguladores de crecimiento

4. Introducción • Teoría Celular, 1838, Schleiden y Schwan • Todos los organismos están compuestos de células • Toda célula se origina a partir de otra célula • ¿Cómo originar célula nueva? • Información de cómo realizarlo • Capacidad de síntesis de todos los componentes (duplicar todo) • Mecanismo de control del proceso • Avance • Asegure la fidelidad del proceso

7. G1 12 horas S 6 horas G2 6 horas M 0.5 horas

10. Experimentos de Fusión de células de Mamíferos: • Orden de etapas • Núcleo emite instrucciones • M: induce a G1, S, G2 a avanzar en orden (ALTERNAMIENTO) • Etapas deben finalizar antes de iniciar otras (TERMINACIÓN) • S induce G1 a duplicar ADNl • S no induce a G2 a replicar • Block a re-duplicación Rae, P. N., & Johnson, 1970 Johnson and Rae, 1970

11. Análisis bioquímico del ciclo celular (estudio en células embrionarias) • Xenopus laevis • Células grandes 1mm • Posible obtener en gran número, 1 hembra produce miles • Gran número en espacio reducido • Gran número en corto tiempo • Divisiones iniciales son sincronizadas

12. Ciclo de vida de Xenopus laevis

13. Células del Folículo Detiene en Metafase II

14. DESCUBRIMIENTO DEL MPF (FACTOR DE PROMOCIÓN DE LA MITOSIS/MADURACIÓN) Masui, Y., & Markert, C. L., 1971.

15. Medición de MPF en proceso de oocito a blástula Gerhart, ., Wu, M., & Kirschner, M.J. ,1984

16. MPF también induce mitosis

17. Actividad MPF independiente de ensamblaje del huso (nodoconazole) síntesis de DNA (afidicolina) Xlt: independiente del estado del núcleo!??? Motor del ciclo celula todas las reacciones que inducen la activación o inactiviación de MPF Eventos secundarios Eventos inducidos por la act. o inactiv. de MPF

18. Eventos secundarios Alta MPF Motor del CC Baja MPF Eventos secundarios

20. Descubrimiento de la CICLINA Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngblom, J.. Distel, D.. & Hunt, T.1983

22. Evidencias de estudios bioquímicos • Ambos ensayos (exp. de inyección y de fusión) prueban que las células mitóticas tiene un factor inductor dominante • Oocitos, MPF oscila aún si DNA no está replicado, no en exp. de fusión • Se creyó que ambos sistemas poseían regulación diferente. • Sistema de inyección en oocytos (maduración) permitió tener un sistema para purificar MPF pero: • MPF difícil de purificar • Experimento era difícil de realizar • Se creía que control de meiosis era diferente de mitosis

23. Análisis genético del ciclo celular(estudio en levaduras) • Dos tipos de levaduras • Saccharomyces cerevisiae (pan, vino, cerveza) levadura de fisión • Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemación • Ventajas • Rápido crecimiento (división cada 90 min) • Medio de crecimiento sencillo • Genoma pequeño • Fácil de detectar etapas del ciclo celular (tamaño de gema) • Inicio de gemación coincide con paso por INICIO (START) • Unicelulares • Sistema ampliamente estudiado desde 1960’s

24. Diferencias con células embrionarias • Se detectan dos Puntos de Control • Entrada a S, regula tamaño de célula • Entrada a M, chequea duplicación del ADN • Mitosis es cerrada (no se rompe memb. Nucl. • Ensamblaje de huso inicia antes de finalizar duplicación de DNA • Difícil detectar el ingreso M • Tamaño de gema indica etapa del CC

25. Budding yeast • Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) • levadura de gemación • Budding yeast

26. Budding yeast Identificación de mutantes del CC 32 mutantes cdc “cell division cycle”

27. Budding yeastv Mapa de Mutantes Hartwell, L. It, Culotti. J., P J. R., & Reid, 1974

28. Budding yeast • Proteína esencial para el avance del CC • No permite ingreso a S, este punto del cc se define como INICIO (START), no permite ningún evento secundario • Luego de este punto la célula esta comprometida a completar el CC • La célula coordina crecimiento y motor del cc • La célula evalúa estado nutricional, si es pobre detiene CC (diferente a embriones)

29. Quién es cdc28? • Tendrá alguna relación con MPF?

30. Fission yeast • Saccharomyces cerevisiae (levadura común) • Levadura de fisión (método de división) • Fission yeast

31. Regulación del tamaño • División ocurre siempre a un tamaño dado • Longitud del ciclo celular es mayor en células hija que en células madre (By). • Falta de nutrientes detiene CC en INICIO By y en ENTRADA A MITOSIS en Fy • Lo anterior refleja una evaluación del ambiente externo para permitir la continuación del CC

32. Enzimas que controlan CC • 2 modelos: • Xenopus, motor del CC sin control, embriog. • Levaduras, alto regulación del CC, somática • Mutantes: • wee1 • cdc 25

33. Wee1+ • wee1- (ts): • Mutante de Fy • células se dividen a un tamaño menor • Posible inhibidor de avance del CC hasta alcanzar tamaño adecuado, al mutarse pierde su actividad como inhibidor • Actividad en INICIO o en ENTRADA A MITOSIS • Al aumentar temperatura se da explosión de M no de S, se elimina control de tamaño para M, ahora punto de control es en INICIO

34. Fission yeast Se reflejan 2 puntos de Control: ENTRADA A MITOSIS INICIO

35. Fission yeast cdc25+ • cdc25 (ts): • Mutante de Fy • Detienen ciclo antes de M pero continuan creciendo • Mutación puede ser rescatada por wee1-

36. Fission yeast cdc2+ • cdc2 (ts): • Mutante de Fy • Detienen ciclo antes de M pero continuan creciendo • Mutación no puede ser rescatada por ninguna otra mutación

37. Detiene en G2 Mutación dominante cdc13mismo fenotipo que cdc2 ts

38. Russell, P., & Nurse, P. (1987).

40. Clonaje de genes por complementación

42. La unión de ambos estudios

43. Integración de By y Fy • Es posible complementar cdc2 con cdc28 y viceversa • 63% de identidad en la secuencia de aa • Cdc2 ENTRADA A MITOSIS y cdc28 INICIO ? • Homólogo de cdc2 en humanos, capaz de rescatar cdc2 Fy => sistema conservado

44. Integración de mutantes y MPF • Se logra purificar MPF • 1 L huevos pocos ug de MPF • 2 bandas 34 KDa y 46 KDa • Se supuso que era cdc2 y cdc13 (ciclina) • Anticuerpos lo demostró • MPF tenía actividad kinasa • Sustrato Histona H1

45. La ciclina y el ciclo celular Es la ciclina la única proteína involucrada en la oscilacion del CC

46. Sistema in vitro de ciclo celular

47. Murray, A. W., & Kirschner, M. W.(1989) Adición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisiones

48. ANTISENSE mRNA

49. Eliminación de un fragmento de 90 aa (caja de destrucción) del terminal amino del gen de ciclina: destrucción necesaria para salir de mitosis.