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Population A Tester

Population A Tester. Population B Driver. RNA. RNA. RT avec oligodT. cDNA. Dénturation/hybridation Excès de driver. Clonage dans un vecteur. Hybridome T spécifique d’un antigène Y. Hybridome T spécifique d’un antigène X. Isolement des ARN polysomaux associés aux membranes.

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Presentation Transcript

  1. Population A Tester Population B Driver RNA RNA RT avec oligodT cDNA Dénturation/hybridation Excès de driver Clonage dans un vecteur

  2. Hybridome T spécifique d’un antigène Y Hybridome T spécifique d’un antigène X Isolement des ARN polysomaux associés aux membranes ARN polyA+ cDNA ARN polyA+ Soustraction en utilisant un lymphome B Synthèse des cDNA en présence de dXTP a32P Synthèse du second brin Soustraction en utilisant un lymphome B Construction d’une banque par clonage dans pBR322 Criblage de la banque 35 clones 30 spécifiques des cellules T

  3. Cellules T

  4. Extraction ARN : 2 échantillons A et B GCAAAAA CGTTTTTT RT avec amorces poly(T)12MN GCAAAAA CGTTTTTT CGTTTTTT • PCR • Amorces poly(T)12MN • Décamères arbitraires A B Identification (base de données) Excision, extraction, PCR et clonage dans un vecteur Séquençage Vérification de l’expression différentielle Migration sur gel polyacrylamide autoradiographie

  5. Marquage Marquage

  6. cDNA array

  7. 3’ 5’ PM : A t c g t c g t t a t c g t t g c t g c MM : A t c g t c g t t g t c g t t g c t g c MM PM

  8. Marquage de la sonde Hybridation T7 cDNA B cRNA B B B (T7RNA pol)

  9. Fabrication des puces

  10. SAGE : Serial Analysis of Gene Expression SAGE permet une analyse de la fréquence d'un ARN messager parmi les milliers produits dans une cellule à un moment donné. Une étiquette (tag) est une séquence de 10 ou 14 nucléotides caractéristique d'un ARNm d'une cellule. Les étiquettes, isolées grâce à l'action des enzymes de restriction, sont liées bout à bout en une seule séquence qui est clonée, amplifiée par PCR et séquencée. Analyse informatique du taux d'expression des ARNm à partir de cette séquence. • Une courte séquence de 10 à 14 nt permet d’identifier un transcrit : TAG • Ces séquences peuvent être liguées entre elle dans un vecteur puis séquencées • La fréquence avec laquelle un TAG est observée est proportionnelle au niveau d’expression

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