Antimikrobiella peptider

1. Antimikrobiella peptider #Högt innehåll av positivt laddade aminosyror, katjoniska peptider #Förmågan att anta en amfipatisk struktur Hydrofil, positivt laddade aa Hydrofob, oladdade aa

2. Hydrofob Laddad (+) Polär Exempel på amfipatisk katjonisk helix

3. Laddade aa Hydrofoba aa Neutrala aa Hp(2-20), a-helix peptid

4. Historia 80-tal Hur försvarar sig enkla organismer (t.ex insekter) mot bakterie infektioner? -Enkla bakteriedödande peptider 00-tal Liknande peptider hittade hos nästan alla organismer man letat (inkl. växter), tros nu vara extremt viktiga även hos högre djur (däggdjur) som ett snabbt och ospecifikt “first line of defence” vid infektioner och som en länk till det adaptiva immunförsvaret

5. Kännetecken # Enkla molekyler; ca 10-80 aminosyror # Varierande strukturer; helix, sheet, ringstruktur, loopar mm. # Brett spektrum; G+, G-, svamp (vissa även antivirala) # Interagerar med membraner # Dödar snabbt

6. Antar helixstruktur i lipidmembran, tex. cecropiner -helix Stabiliseras av disulfidbryggor, tex. defensiner -sheet Stabiliseras av disulfidbryggor, tex. protegriner Loop-struktur Olika grupper Peptider från de olika grupperna är homologa, men har låg sekvenslikhet  de har evolverat oberoende av varandra

7. 1. Störning av membranstruktur LPS + + + + + + + + Membran + + + + 2. Porbildning 3. Mot cytoplasmamembran + + + + Bakteriedödande mekanism Antimikrobiell peptid + + + +

8. Munhåla Lungor Tarm Urogenitalt Hud Förekomst i däggdjur Epitel Där bakterier först kommer i kontakt med kroppen Fagocyterande celler För att bidra till avdödningen av fagocyterade bakterier, ligger lagrade i intracellulära organeller, granule.

9. Humana granulocyters abp #Komplex arsenal av antimikrobiella substanser, synergi effekter #Toxiska syre radikaler #Antibakteriella proteiner (t.ex Lactoferrin, BPI) med katalytiska funktioner bryter ner bakteriella beståndsdelar -För stora för att klassas som abp #Två grupper klassas som abp; Defensiner Cathelicidiner

10. Defensiner #29-34 aa, 3 disulfidbryggor, cyklisk -sheet struktur #4 humana varianter #-defensiner finns i mycket höga koncentrationer i fagocyter, frisätts in i fagosomen –toxiska mot värdceller vid höga koncentrationer #-defensiner finns i epitel

11. Defensiner II #Direkt antimikrobiella Bredspektrum antibiotika (G+, G-, svamp, virus) Nedsatt aktivitet vid fysiologiska saltkoncentrationer!! ?? #Indirekt antimikrobiella Opsoniserande förstärker upptag och avdödning av fagocyter #Indirekt immunoreglerande Aktiverar mastceller Stimulerar cytokinproduktion i epitel Attraherar immunceller t.ex monocyter, DC, T-celler och makrofager Ospecifikt immunsvar Specifikt immunsvar

12. peptid pro pre 29-30 aa 98-114 aa 12-100 aa Cathelicidiner #Extremt heterogen grupp peptider med stora likheter i pre-pro sekvenserna #Den aktiva peptiden bildas då pre-pro delarna klyvs bort, bland de olika aktiva cathelicidinerna finns alla olika grupper av abp representerade #Oklyvda pro-formen kan frisättas utanför cellen #Troligen har pre-pro delen viktiga funktioner; leverans, targeting, aktivering

13. Cathelicidiner II LL-37 =aktiv del av human cathelecidin, a-helix peptid #Direkt antimikrobiell, bredspektrum #Binder och neutraliserar LPS inflammatorisk respons #Attraherar och aktiverar fagocyter/inflammatoriska celler #Stimulerar immunceller inflammatorisk respons LL-37 kan alltså både upp- och nedreglera immunresponsen, fungerar som en sk. immunomodulator

14. Hur viktiga är abp för vårt immunförsvar? #Specific granule deficiency; Saknar a-defensiner i fagocyterande celler –lider av återkommande, allvarliga infektioner #Brännskador; Sepsis ansvarar för 60% av dödsfallen vid allvarliga brännskador Huden försvinner = fysisk barriär Bränd hud tappar förmågan att tillverka defensiner #Cystisk Fibros; Kroniska bakterieinfektioner (P. aeruginosa), inflammation och nedbrytning av lungvävnad

15. Abp som klinisk antibiotika Fördelar Nackdelar #Potenta (in vitro) #Brett verknings spektrum (inkl. svamp & virus) #Dödar snabbt #Binder LPS = antiendotoxin #Aktiva även mot multiresistenta stammar #Få resistenta stammar #Dyra att syntetisera #Svåra att framställa transgent i bakterier eller jäst då peptiderna dödar dessa celler #Fungerar inte lika bra in vivo –behöver ”rätt” salthalter o höga koncentrationer....

16. Abp som klinisk antibiotika Inom sjukvård #FasIII, -helix peptid mot topiska infektioner, bensår o.dyl #FasII, loop-peptid mot CF (aerosol), munhåleinfektioner #Fas I & II, -sheet peptid mot multiresistent S. aureus olika peptider mot sepsis och endotoxisk shock Övriga användningsområden #Transgent uttryck i växter  resistens mot bakterie/svamp angrepp #Transgent i köttdjur  minskad användning av antibiotika inom djuruppfödning

17. Resistens-utveckling? #Inaktivering/nedbrytning av peptiden #”Kamouflage” av ytstrukturer, för att minska inbindning av peptid, t.ex modifiering av LPS (mindre negativ laddning) #Återupprättande av den peptid-inducerade störningen #Vissa patogena stammar av Salmonella uppvisar en viss resistens, tätt linkat till virulens

18. Resistensmekanismer Nedbrytning mha frisatt eller ytbundet peptidase LPS modifiering yttre membran periplasma inre membran intracellulära peptidaser cytoplasma

19. Varför är resistens så ovanligt? #Avsaknaden i specifika mål-molekyler? #Komplexiteten i avdödningsmekanismen? Inga enkla mutationer ger resistens, större förändringar och/eller nya system krävs #Komplex arsenal av antibakteriella substanser in vivo? #Snabb avdödning?

20. Triclosan Bakterieparanoia in absurdum 5-Chloro-2(2,4-dichlorophenoxy)phenol Vanligaste antibakteriella substansen i tvål, tandkräm, rengöringsmedel, köksprodukter, leksaker mm. Ansedd vara ofarlig för djur och människor, lätt nedbrytbar och ha en ospecifik avdödningsmekanism. Användadet av Triclosan har ökat enormt de senaste åren.

21. Risker med Triclosan Triclosanhar en specifik avdödnings- mekanism! Blockerar ett bakterie-specifikt enzym, Enoyl-acyl carrier protein reductase, involverat i fettsyre syntes. Resistenta stammar har identifierats Inte så lätt nedbrytbar som man trott, Triclosan har hittats i reningsverk och bröstmjölk Vissa mildare biverkningar har hittats hos människor, mest olika hud irritationer Dioxin bildas vid förbränning av Triclosan Numera klassat som ”miljöfarligt”

22. Att tänka på vid antibakteriell drug-design Specificitet: värdcell : bakterie normalflora : patogen Target: hur “komplicerat” är det för resistensmekanismer att uppstå? finns liknande targets i andra celler? Övrigt: bieffekter, nedbrytning, bio-tillgänglighet, kostnad (gäller alla droger) Situationen in vivo är alltid mer komplex än i provröret...

23. Nya strategier för antibakteriell drug-design För att motverka resistensutveckling försöker man undvika “enkla” direkta targets: # komplexa targets  abp # indirekta targets? kan man istället för att döda mikroberna direkt trigga någon del av immunfösvaret till att ta hand om infektionen på ett effektivt sätt med många olika avdödningsmekanismer som agerar i synergi?

24. Pattern Recognition • PAMP (“Pathogen Associated Molecular Pattern”); Strukturer som delas av ett stort antal patogena mikroorganismer, ofta nödvändiga för virulens/överlevnad. • Ex. • # LPS • # Peptidoglukan • # Lipoteikonsyra • # Bakteriespecifika socker • # Dubbelsträngat RNA • # formylerade peptider • Igenkänning av dessa strukturer är medfödd, kodas genomiskt och ärvs  “Innate immunity” • Receptorer förekommer på antigen presenterande celler, fagocyter, epitelceller

25. #Receptorer känner igen PAMP #Receptorer och signalleringskomponenter hittades först hos insekter; sätter igång produktion av abp vid infektioner #Stora homologier i däggdjur  evolutionärt mycket viktiga system Toll-signalering

26. Aktiverar det snabba ospecifika immunsvaret Mobiliserar och förbereder det långsamma adaptiva immunsvaret Toll-signallering Insekter: Aktivering av Toll-signallering leder till ökad produktion av abp Däggdjur: Aktivering av Toll-signallering leder till; #Inflammation #Aktivering och tillväxt av antigen presenterande celler #Aktivering av fagocyter

27. O H C NH CH CH 2 CH 2 S CH 3 Kan man få mikroben att öka sitt uttryck av PAMPar? Bakterier (men inte eukaryoter) är beroende av deformylering av sina proteiner, mha ett peptid deformylase (PDF) PDF inhibitorer kan döda bakterier, men kräver höga koncentrationer Vid subletala doser av PDF inhibitorer ÖKAR bakteriernas frisättning av formylerade peptider som är en PAMP. Dessa är potenta aktivatorer av det ospecifika immunförsvaret och kan mobilisera det specifika PDF inhibitorer borde kunna fungera som indirekt antibiotika och lokalt öka PAMP koncentrationerna och trigga immunförvarets olika komplexa avdödnings- mekanismer ?????

28. Multifunktions molekyler Många abp (defensiner & cathelecidiner) kan binda och neutralisera PAMPar (tex. LPS) och därigenom dämpa immunresponsen. Samma abp kan också direkt attrahera och aktivera celler som deltar i immunresponsen.

29. From: Bowdish, D. M. E., Davidson, D. J., Hancock, R. E. W. (2005).Curr. Prot. Pep. Sci, 6(1); 35-51 ?? Koncentrationsberoende ?? ?? Komplex balans ?? ?? Andra faktorer??