p rof. M. Kamiński GDAŃSK 2013

1. InstrumentalneMetody Badania Strukturyi Aktywności Biomolekuł(IMBSiAB)podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013

2. Cel ćwiczenia - zasadniczy Poznanie w praktyce metodologii / metodyk postępowania dla doboru optymalnego układu rozdzielczego typu HPLC do rozdzielania peptydów / białek i otrzymania frakcji w celu dokonania, następnie, badań struktury molekularnej ,właściwości „użytkowych” itp. na przykładzie rozdzielania składników supernatantu hodowli bakteryjnej dla wydzielenia aktywnej formy naturalnych antybiotyków peptydowych (bakteriocyn) – „stafylokokcyn” - „St T”, lub St C”.

3. Cele dodatkowe • Poznanie alternatywnych układów LC, umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego – izolacji aktywnej formy naturalnego antybiotyku peptydowego; • Poznanie zasad i sposobów określania (wyznaczania / obliczania) oraz doboru („projektowania”) optymalnych wartości „parametrów operacyjnych” dla wybranych alternatywnych układów rozdzielczych, potencjalnie umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego; • Zespołowerozwiązywanie problemów oraz zespołowa praca nad przygotowaniem raportu z badań • Poznanie „techniki” LC/HPLC i najważniejszych problemów, które mogą mieć miejsce

4. Zasada realizacji ćwiczenia oraz przygotowania sprawozdania – raportu z badań • Praca eksperymentalna w „podgrupach” • Zespołowe opracowanie wyników przez podgrupy przygotowanie części sprawozdania / raportu z badań podgrupy, wraz z wynikami obliczeń najważniejszych parametrów operacyjnych i wnioskami, wynikającymi z badań podgrupy • Zespołowe opracowanie sprawozdania całej grupy oraz opracowanie zależności / wniosków dodatkowych tzn., „części spinającej” badania w podgrupach, ew. obliczenie / wyznaczenie dodatkowych parametrów / zależności funkcyjnych możliwych do określenia dopiero na podstawie badań poszczególnych podgrup – łącznie oraz sformułowanie dodatkowych wniosków

5. Etapy procedury, skala operacji, układy rozdzielcze, opis warunków i parametry operacyjne rozdzielania • Przygotowanie „wsadu” / „pre-rozdzielanie” / rozdzielanie „właściwe” jedno-, najczęściej, wielo-etapowe z zastosowaniem detekcji - jeden, albo kilka detektorów HPLC, połączonych szeregowo lub równolegle/ kontrola czystościfrakcji (z zastosowaniem „analityki instrumentalnej , w tym, HPLC)/ kontrola aktywności antybiotycznej), // wydzielanie „produktu” / „doczyszczanie” (poza ramami czasowymi ćwiczenia) • Skala modelowa/ powiększanie skali rozdzielania (poza ramami czasowymi ćwiczenia) • GPC / SEC – H (war. hydrofilowe)– rozdzielanie wstępne, odsalanie; RP /HILIC // IExC / IExcl– (jedna z tych odmian chromatografii nieprzydatna dla peptydów i białek – która ?) • Parametry „operacyjne” - rodzaj sorbentu / powierzchnia sorpcyjna (A), wielkość porów (d/ Δd), kształt i wielkość ziaren wypełnienia kolumn/y (dp / Δdp), natężenie przepływu eluentu (w) / liniowa prędkość (u) / średnica (dc), długość kolumny (Lc), stężenie roztworu dozowanego (Cmix) / objętość dozowana (Vi) rozpuszczalnik roztworu dozowanego , korzystnie -w przeliczeniu na jednostkę masy / objętości / powierzchni wypełnienia kolumny // jednostkę przekroju poprzecznego kolumny

7. „TECHNIKA”

8. Przykłady otrzymanych przez Państwa wyników rozdzielania, przebiegu chromatogramów, widm UV-VIS / RID - do opracowania, sformułowania wniosków w sprawozdaniach podgrup / grup laboratoryjnych

9. PRE-rozdzielanie / odsalanie GPC/SEC – H kolumna HPLC – DIOL 100

10. RP-HPLC – elucja gradientowa, detekcja UV-VIS-DAD Możliwość określenia widm / identyfikacji wstępnej na podstawie UV-VIS (proszę zwrócić uwagę na : ewentualność wykluczania, wartość długości fali w maksimum widm, okoliczność absorpcji światła UV przez St-T/St-C do 305 nm / ewentualność wytrącania się składników mieszaniny dozowanej w momencie dozowania do kolumny, zakres zmienności wartości molowych współczynników absorpcji światła składników.

11. Zestawienie chromatogramów różnych wsadów

12. Pik „32,96 min” – składniki o wysokiej hydrofobowości pozostałe w kolumnie po elucji „St” , eluowane w warunkach zwrotnego przepływu eluentu Warunki RP - integrator, zbieranie frakcji; Stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie; Kolejno - badanie czystości frakcji / aktywności a-biotycznej ;

13. Zestawienie widm UV kilku peptydów

14. Nałożenie chromatogramów rozdzielania w tych samych warunkach - RP , elucja izokratyczna

15. Warunki HILIC, elucja izokratyczna – należy preferować elucję izokratyczną w P-LC / P-HPLC, w przypadku rozdzielania peptydów / białek elucja gradientowa może zapewniać lepszą selektywność rozdzielania Kolumna Accucore – HILIC – układ ortogonalny względem RP

16. Chromatogramy dla kilku różnych długości fali światła UV

17. Nałożenie chromatogramów – dwie różne bakteriocyny – St T i St C – HILIC warunki izokratyczne

18. Oznaczenie czystości frakcji Możliwość stosowania nowoczesnych technik chemii analitycznej, w tym HPLC-UV-VIS/DAD; Identyfikacja na podstawie czqasu retencji, oraz dodatkwo, z zastosowaniem widm UV-VIS dzięki detektorowi DAD; Korzystne stosowanie układów „ortogonalnych” , np., rozdzielanie – RP / oznaczanie czystości frakcji / produktu – HILIC lub NP..

20. Płytka #2 Badanie aktywności antybiotycznej

21. Przykłady rezultatów badania aktywności anty-biotycznej – wartości zahamowania strefy wzrostu kolonii bakteryjnej U góry - widok płytki z rezultatami badania aktywności a–biotycznej frakcji; Obok – zahamowanie sterfy wzrostu kolonii bakteryjnej w świetle przechodzącym

22. Problem braku korekty opóźnienia transportowego dla programu elucji - w przypadku niniejszego rozdzielania - najpierw brak „korekty”, potem zbyt „stromy” program elucji