基因操作 (gene manipulation) 分子選殖 (molecular cloning) 之目的，是要大量複製一段指定的核酸片段。

1. 基因操作(gene manipulation) 分子選殖(molecular cloning)之目的，是要大量複製一段指定的核酸片段。 在此過程中，所有的核酸片段均分別被植入載體，然後轉入宿主細胞，在其中大量複製，放大這些核酸片段的數目。同時，因為一個宿主細胞只能讓一種核酸大量複製(1 plasmid, 1 cell)，因此所得到的大量核酸，也是均質的核酸分子。 當一個含有目標核酸的載體進入宿主細胞，載體複製數目可達數百個(x 100)；同時因為細胞本身的分裂，在培養基上長成菌落，每菌落可達數千個細胞(x 1,000)。 因此一特定核酸可經由此種過程，由一個分子放大成數十萬個分子；再以專一性探針或篩選方式，挑出含有所要基因的菌落。 如此，利用分子選殖手法把一段核酸數目放大，並得到純質的核酸片段，是基因操作的基本精神。包括基因選殖及表現(Gene cloning and expression, 基因轉殖)、基因治療(Gene therapy)、生物資訊學(Genomics & bioinformatics)、生物晶片(Biochips)、反義基因(Antisense technique)、PCR基因放大(PCR technology)

7. 選殖載體(cloning vector) • 載體的條件： • 具有複製起點，DNA 才可以在宿主細胞中進行複製。 • 必須相當小才能易於操作。 • 具有許多限制酶作用位置以供選殖 DNA 片段使用。 • 具有選擇性的標記可以用來顯示外來DNA 是否已經被插入載體中，或追蹤重組DNA是否已轉移至細胞中。

11. pGEM-T vector 經Taq DNA聚合酶擴增後的PCR產物末端都帶有單個A。 正是基於這一原理，pGEM質粒經EcoR V切成平端後，在開口端加上一 個T製成T載體，一方面避免了自身環化(Self ligation)，另一方面 由於T-A互補，從而提高了T載體與PCR產物之間的連接效率。 由於T-A克隆只需純化PCR產物，因而操作較為簡便。 含絲狀噬菌體f1 的複製起始區(f1 phage region)， 用於產生環狀ssDNA藉以提高DNA拷貝數. 含有T7 和SP6 RNA聚合酶啟動子來提高轉錄效果. 在MCS(Multiple cloning size)區域具有編碼β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通過藍、白菌落直接篩選重組菌落。

12. T7 RNA Polymerase 基本上是由 T7 phage (一種噬菌體)中發現的一種 RNA 聚合酶,分子量約99kDa 基於這種噬菌體的生長特性，研究學者發現它的 RNA 聚合酶有很強的轉錄活性 ，很適合用來放在質體中大量表現我們所想要的基因，乃至於最後作出蛋白來純化。所以眾多的生技公司將它放置在表現載體中，利用它強而有力的活性，能大量作出目標的基因。專門催化5‘→3’方向的RNA形成過程。 T7 RNA聚合酶具有高度啟動子專一性，且只會轉錄T7噬菌體中位於T7啟動子下游的的DNA或DNA複製品。 此酵素在合成RNA的過程中，需要DNA模板與鎂離子（Mg2+）作為輔因子。牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）及精胺（spermidine）對此酵素具促進效果。 噬菌體之RNA聚合酶如SP6、T3及T7多由一條多胜月太（polypeptide）所構成，在轉錄反應時所需辨認的promoter長度僅20 bp左右，加上轉錄起始位置明確，轉錄效能良好，成了目前進行胞外轉錄反應時的最佳選擇。欲進行胞外轉錄反應時，僅需將目標基因選殖至帶有SP6、T3或T7 promoter的轉錄載體，即可運用SP6、T3或T7 RNA polymerases 活性在試管內合成正（sense）或反股（antisense）RNA。

13. DNA重組成功的篩選方法-菌落藍白篩選 • 確認載體成功進入細菌 • 使用抗生素標記 • 確認基因有接入載體 • lacZ基因被插壞

14. R R

15. 乳糖操作組 CAP P O 半乳糖苷酶 滲入酶 乙醯基轉化酶 無作用之 抑制劑 誘導物 (Klein et al.2003)

16. 半乳糖苷酶 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside )

17. 確定DNA重組成功的方法

18. TA cloning常見之定序問題 • Ligation 效率不佳之問題。 • TA cloning 是利用 non-proofreading DNA polymerase (例如:Taq.Tfl.Tth等)會在PCR產物 3’端加上一個A的特性，作選殖。 但是具許多文獻指出Taq.Tfl.Tth等酵素不僅會在 3’端加一個A， 有一半機率則會加上一個G。 • 有3’→5’外切核酸酶的DNA polymerase (例如Pfu.Vent)不能 用於TA clone。 • TA cloning 可能會有正反接之問題。 • TA cloning 定序曾經發生過 T7 primer有multiple binding site.