Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala: ESTs SAGE Microarray

1. EST SAGE MICROARRAY • Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala: • ESTs • SAGE • Microarray Computational analysis of data by statistical methods

2. ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE • Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico • L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali • In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni

3. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA • Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine • Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione • Principali tipi di regolazione: • Controllo epigenetico • Controllo trascrizionale • Controllo post-trascrizionale

4. “One-gene approach” Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Real Time PCR PCR semiquantitativaIbridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot)Ibridazione in situ “Large-scale approach” Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ? Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Profilo d’espressione del genoma(TRASCRITTOMA)

5. METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA • Sequenziamento sistematico di ESTsda librerie di cDNA • SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) • cDNA microarrays

6. EST EST SEQUENCING mRNA of different genes cDNA LIBRARY

7. EST UniGene Human Release Statistics Total sequences in clusters: 3115711 Total number of clusters sets: 95928 22094sets contain at least one known gene 94710sets contain at least one EST 20876sets contain both genes and ESTs ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE Sample of 12919 ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts eg. Rhodopsin: 65 retina ESTs  65 / 12919 = 0.503%

8. EST

9. EST

10. SAGE SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala per avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997) Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG)

11. SAGE • una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti (una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto). • le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate. • il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente.

12. MICROARRAY Esperimenti di Microarray Permettono l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente

13. MICROARRAY

14. GeneChip Affymetrix Ibridizzazione della sonda marcata Scansione del GeneChip con scanner laser

15. MICROARRAY Analisi dell’immagine • Identificazione della posizione degli spot • Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot • Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot • Calcolo del background locale

16. MICROARRAY Elaborazione dei dati

17. EST SAGE MICROARRAY

18. Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali • Quali geni sono differenzialmente espressi ? • Quali e quanti geni sono coespressi?

19. Obiettivi dell’analisi saranno… • Identificazione geni differenzialmente espressi • Identificazione pattern di espressione comuni • Identificazione di geni coespressi con geni di funzione nota

20. CLUSTER ANALISI Identificazionedi gruppi di geni con profili di espressione simili Simili rispetto a cosa ? distanza Definizione di I geni sono punti nello spazio: punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme

21. CLUSTER ANALISI • DUE STEPS: • Misura di similarita’ • Diverse misure • Standardizzazione dei dati • Linking method • criterio per stabilire i gruppi • Metodi gerarchici e non gerarchici