Co je to molekulární taxonomie Zvláštnosti molekulárních znaků

1. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Náplň kurzu • Co je to molekulární taxonomie • Zvláštnosti molekulárních znaků • Metody získávání experimentálních dat • Metody zpracovávání dat • Biologická interpretace • Vaše dotazy a moje odpovědi

2. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Rozpis přednášek • 23.2. - Zahájení kurzu, taxonomie a molekulárně biologické znaky, metody sekvenace DNA • 2.3. - Databáze sekvencí a vyhledávání v nich (Marián Novotný) • 9.3. - Alignment sekvencí (Marián Novotný) • 16.3. - Získávání nesekvenčních molekulárních dat - multilokusové metody (RAPD, RFPL aj.), mikrosatelity, minisatelity, izoenzymová a alozymová analýza, imunologické metody • Praktikum 19.3.: Získávání sekvencí, alignment, odečet výsledků RAPD/RFLP • 23.3. - Evoluce sekvencí, odhad evoluční vzálenosti (distance) • 30.3. - Fylogenetické stromy I. - anatomie stromů, konstrukce stromů z genetických vzdáleností, algoritmy a hledání stromu s nejlepším skóre • 6.4. - Fylogenetické stromy II. Metoda maximální parsimonie, artefakty konstrukce stromů • 13.4. - Fylogenetické stromy III. - Metoda maximum likelihood, Bayéská metoda • 20.4. - Fylogenetické stromy IV. - Multigenové analýzy, určení věrohodnosti větvení stromů, nalezení kořene, testy topologie, datování pomocí molekulárních hodin • Praktikum 23.4.: Konstrukce stromů ze sekvencí DNA a z RAPD/RFLP dat • 27.4. - Identifikace jedinců, určování rodičovství, DNA barkóding • Praktikum 30.4.: Konstrukce stromů ze sekvencí proteinů • 4.5. - Vnitrodruhová fylogeneze, struktura populace a genový tok, fylogeografie, příklady • 11.5. - Speciace a hybridizace, kryptické druhy, příklady – odevzdání nepovinného eseje • Praktikum 15.5.: Různé testy, zpracování dat získaných analýzou mikrosatelitů • 18.5. - Prezentace studentů

3. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Zkouška Součásti zkoušky: Písemná část (5 příkladů) – maximální zisk 10 bodů Ústní část – maximální zisk 10 bodů Nepovinný esej (2-3 strany) a jeho prezentace (10 min.) – 4 body Hodnocení: 11-13 bodů – dobře 14 – 17 bodů – velmi dobře 18 a více - výborně

4. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Materiály ke studiu • WEB (Hampl): http://web.natur.cuni.cz/~vlada/moltax/ • WEB (Flegr): http://web.natur.cuni.cz/~flegr/moltaxmater.php • KNIHY • Flegr J. Evoluční biologie, Academia 2005. • Kapitoly: IX.Evoluce sekvence DNA a XXIV. Molekulární fylogenetika • Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Sinauer Associates, Inc., 2004 • Felsenstein J. Inferring phylogenies. Sinauer Associates, Inc., 2004 • Nei M. & Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. Oxford Univ. Press, 2000

5. Molekulární taxonomie Co to je za obor? Taxonomie (systematika) využívající molekulárně biologické znaky. Taxonomie (systematika) = Snaží se katalogizovat biodiverzitu a uspořádat ji do systému obvykle hierarchicky řazených skupin. Rozdíly v sekvenci DNA (potažmo proteinů). Nepatří sem znaky na jiným molekulách (lipidy, polysacharidy, proteoglykany, terciární struktury proteinů aj.)

6. Taxonomie Podle většinového názoru taxonomů je nejlepším přirozeným systémem organizmů ten, který odráží průběh jejich fylogeneze. Fylogenetika – zabývá se vznikem a vývojem linií organizmů. Rekonstruje průběh kladogeneze (větvení), ale všímá si i anageneze vývoje vlastností organizmů v rámci linie.

7. Taxonomie Existují různé názory na použitelnost znaků pro rekonstrukci fylogeneze: Fenetika (podobnost) – používá všechny znaky Kladistika(důraz na příbuznost) – používá výhradně synapomorfie x1, y1, z1 = plesiomofie x2 = synapomorfie pro BCD y2 = autapomorfie pro B z2 = homoplázie (konvergence) pro ED

8. taxonomie Numerická taxonomie (60. minuleho století) – první pokus o objektivizaci taxonomie. Kladli důraz na použití velkého množství dat a vyvinuli matematické postupy, jak z nich vypočítat celkovou podobnost (nebo naopak odlišnost - distanci) mezi taxony. Je to tzv. fenetický přístup. Kritizovánikladisty za to, že jim nevadí homoplázie. Metody konstrukce stromů označované jako fenetické(založené na distancích) byly nebo jsou kladisty neprávem zavrhovány. Kladistické metody (maximální parsimonie)se v praxi dostávajído podobných obtíží, nemají vodítko, jak rozeznat homoplázie a konflikty mezi znaky řeší nakonec podobně jako „fenetické“ metody.

9. Taxonomie Na základě znalosti fylogeneze lze určit, které taxony vytvářet nesmíme, není však možné určit, které taxony vytvářet máme nebo musíme.

10. Taxonomie • Základním požadavkem na přirozený taxon je jeho monofyletičnost. • Monofyletický taxon je • takový, jehož členové si jsou vzájemně příbuzní více, než je kdokoli z nich příbuzný druhu mimo tento taxon • jinak řečeno, takový, který zahrnuje všechny potomky jednoho předka Monofyletický (přípustný pro evoluční taxonomy i kladisty) Parafyletický (přípustný pro evoluční taxonomy) Polyfyletický (nepřípustný)

11. Molekulární taxonomie Co to je za obor? Taxonomie (systematika) využívající molekulárně biologické znaky. Taxonomie (systematika) = Snaží se katalogizovat biodiverzitu a uspořádat ji do systému obvykle hierarchicky řazených skupin. Rozdíly v sekvenci DNA (potažmo proteinů). Nepatří sem znaky na jiným molekulách (lipidy, polysacharidy, proteoglykany, terciární struktury proteinů aj.)

12. Výhody molekulárních znaků 1. Jsou genetické Víme jak se dědí, nezávisí na prostředí ani genetickém pozadí. Je to právě ta úroveň kde vznikají evoluční novinky – mutace v DNA. 2. Je jich obrovské množství: Velikost genomů se pohybuje od 0,5*106 – 600*109. Lidský genom obsahuje přes 3 miliardy párů bazí. Odhaduje se, že lidé se mezi sebou liší v 0,1% tj 3 miliónech bazí.

13. Výhody molekulárních znaků 3. Jsou použitelné od těch nejvzdálenějších srovnání … ACCTGGATGCACTTGAATGCACTTCGATGGACTTCAAGGG

14. Výhody molekulárních znaků 3. … až po porovnávání jedinců téhož druhu

15. Výhody molekulárních znaků 4. Jsou selekčně neutrální Podle nich rozlišíme homologii a homoplázii Sup africký Kondor andský Sup africký

16. Výhody molekulárních znaků 5. Dají se jednoznačně popsat 6. Jsou nezávislé 7. Jsou lépe vážitelné 8. Lépe se kvantifikuje stupeň nejistoty ACCTGGATGCACTTGAATGCACTTCGATGGACTTCAAGGG 2 1

17. Výhody molekulárních znaků • Molekulární hodiny • Polarita evolučních změn • Informace o dřívější struktuře populace

18. Nevýhody molekulárních znaků • Neposkytují informaci o anagenezi • Cena • Někdy destruktivní charakter

19. Neutrální teorie evoluce • „…Naprostá většina substitucí na úrovni DNA vznikla náhodnou fixací (pomocí genetického driftu) selektivně neutrálních (= stejně dobrých) mutantů…“ (Kimura 1991) • Aby bylo jasno: • Neutrální teorie netvrdí, že většina genů je postradatelná, ale tvrdí, že většina forem (alel) téhož genu je funkčně stejně dobrá. • Neutrální teorie netvrdí, že jsou mutace se škodlivým efektem, které jsou eliminovány přírodním výběrem, ale tvrdí že takových mutací je menšina. • Neutrální teorie nezavrhuje darwinistickou adaptivní evoluci poháněnou přírodním výběrem, ale tvrdí, že většina mutací je pro přírodní výběr „neviditelná“ a k adaptivní evoluci nepřispívá. • Neutrální teorie nejlépe vysvětluje, kde se bere tolik polymorfismu (rozdílů) v DNA.

20. Genetický draft – svezení se Neutrální mutace, které se vyskytují poblíž výhodné mutace se v populaci rychle fixují společně s výhodnou mutací.

21. závěr • Pro tvorbu přirozeného systému je nezbytné znát fylogenezi organizmů • Je dovoleno vytvářet jen monofyletické případně parafyletické taxony • Molekulární znaky mají spoustu důležitých výhod • Molekulární znaky jsou vhodné pro studium studium kladogeneze nikoli anageneze • Molekulární znaky vznikají převážně neutrální evolucí a k jejich fixací přispívá genetický draft

22. SEKVENACE DNA

23. Sangerova metoda - I PCR Amplifikace Vložení do plazmidu Sekvenace

24. Sangerova metoda - II G G G G Kapilární elektroforéza

25. Nextgenerationsequencing Díky masivní paralelizaci (najednou sekvenují milióny templátů ) dokáží v krátkém čase vygenerovat obrovské množství sekvencí. Cena za 1 bázi podstatně klesá. = SOLiD™

26. 454 – emulzní PCR

27. 454 – destička

28. 454 – chemie pyrosekvenování

29. 454 – výstup

30. 454 – to je ten stroj Jonathan M. Rothberg

31. Illumina http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21

32. Illumina http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21

33. Illumina http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21

34. Illumina http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21

35. SOLiD

36. SOLiD

37. SOLiD

38. SOLiD

39. SOLiD

40. závěr Porovnání některých parametrů technologií sekvenace DNA Metody jsou různě vhodné k různým účelům. Na „de novo“ sekvenování je nejvhodnější Sanger a 454. SOLiD a Illumina je lepší na re-sekvenování. Dobré je metody kombinovat. '3rd generation' ('next-next-generation') sequencing klepe na dveře – systémy založené na jedné molekuly – společnosti VisiGen and Helicos.

41. PCR