Pengenalan laboratorium, alat & media

Pengenalan laboratorium, alat & media II

Lab. Kultur jaringan Kegiatan kultur jaringan di dalam laboratorium: • Persiapan media dan bahan tanaman. • Isolasi dan penanaman. • Inkubasi dan penyinaran kultur

Ruangan • Ruang persiapan & ruang stok • Ruang isolasi & penanaman • Ruang kultur • Ruang mikroskop atau ruang analisa

Autoclave Timbangan Analitik Peralatan gelas dan labu takar Peralatan

Entkas Centrifuge LAF Mikroskop Hot Plate Stirer Shaker

MEDIA TANAM MEDIA TANAM • Menyediakan air • Menyediakan kebutuhan hara mineral • Menyediakan vitamin • Menyediakan zat pengatur tumbuh • Membuang sisa metabolisme tanaman Fungsi

Komposisi Komposisi • Air • Garam mineral • Sumber karbon • Vitamin • Senyawa organik komplek • Zat pengatur tumbuh • Buffer • Bahan pemadat • Arang aktif

Air • Air distilata • Aquabides (air destilata ganda) Garam Mineral 1. Hara Makro • Nitrogen : NO3-, NH4+ (25-60 mM) • Kalium : KCl or K2HPO4 20 -30 mM • Fosfor : K2HPO4 or KH2PO4 1-3 mM • Kalsium : CaCl2 or Ca(NO3)2 1-3 mM • Magnesium : MgSO4 1-3 mM • Sulfur : SO4 1-3 mM

2. Hara Mikro • Besi (Fe) : 1 m M • Mangan (Mn) : 5-30 m M • Seng • Boron (B) • Tembaga :0.1 m M • Molybdenum : 1 m M • Cobalt (Co): 0.1 m M

Sumber Karbon • Jenis : • sukrosa • glukosa, maltosa, dan rafinosa • Fruktosa dan galaktosa • Konsentrasi optimum sukrosa tergantung dari jenis jaringan yang dikultur. • Pada kultur kalus dan pucuk, 2-4 %. • kultur embrio, mencapai 12 %. • Fungsi Gula : • sumber energi • sebagai penyeimbang tekanan osmotik media

Vitamin, Asam Amino dan Senyawa N Organik Vitamin • thiamine (vitamin B1 esensial dalam kultur jaringan tanaman • nicotinic acid (niacin)  media kultur akar tomat, ercis dan lobak • pyridoxine (vitamin Bkultur akar tomat • Myo-inositol / meso-inositol / i-inositol  memperbaiki pertumbuhan & morfogenesis • Pantothenic acid pertumbuhan jaringan tanaman tertentu, seperti Salix sp • Vitamin E (tocopherol)

Asam amino dan senyawa N organik • L-methionine • arginine, • urea, • glutamine, • asparagin • dan amonik

Zat Pengatur Tumbuh • diperlukan untuk mengendalikan dan mengatur pertumbuhan kultur tanaman • mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, dan organ

Auksin • untuk merangsang kalus, suspensi sel dan organ. • Pemilihan jenis dan konsentrasi, tergantung dari : • Tipe pertumbuhan yang dikehendaki. • Level auksin endogen. • Kemampuan jaringan mensintesa auksin. • Golongan zat tumbuh lain yang ditambahkan.

Sitokinin • sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. • untuk menstimulus pembelahan sel dan merangsang pertumbuhan tunas pucuk • Fungsi sitokinin antara lain adalah: • Memacu terbentuknya organogenesis dan morfogenesis. • Memacu terjadinya pembelahan sel. • Kombinasi antara auxin dan sitokinin akan memacu pertumbuhan kalus.

Giberilin • Diferensiasi atau perbanyakan fungsi sel, terutama pembentukan kalus • Pengaruh positif giberelin: • dalam kultur bit gula GA3 merangsang pembentukan pucuk dari potongan inflorescence • Pertumbuhan kultur pucuk kentang juga baik bila 0.10-0.10 mg/l GA3 dikombinasikan dengan 0.5-5.0 mg/l kinetin • Fungsi geberelin antara lain adalah: • Mematahkan dormansi • Memacu perkecambahan. • Memacu terjadinya proses imbibisi.

Bahan Pemadat AGAR • Keuntungan dari pemakain agaradalah : • Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperature 100o C,  kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. • Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman. • Tidak bereaksi dgn persenyawaan-persenyawaan penyusun media.

Kekentalan media dipengaruhi : • Merek agar yang digunakan, merek agar yang berbeda, memberikan kekentalan yang sedikit berbeda walaupun beratnya sama. • pH media. • Penambahan arang aktif. Arang aktif 0.8-1 g/l menghambat pembekuan agar

Gelrite • Sifat-sifat • Gelnya lebih jernih • Untuk memadatkan media dibutuhkan lebih sedikit (1,5 -3 g/l) kekerasan gel dr gelrite sangat dipengaruhi adanya garam-garam : NaCl, KCl, MgCl2.6H2O & CaCl2 Garam NaCl dan KCl menurunkan kekerasan gel MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekerasan gel 3) Lebih murni dan konsisten dalam kualitas. • Gelrite : cenderung menaikkan kelembaban nisbi (RH) dalam kultur verifikasi

Arang Aktif atau Charcoal • adalah arang yang sudah dipanaskan selama beberapa jam dengan menggunakan uap atau udara panas • sifat adsorpsi yang sangat kuat • Arang aktif dapat ditambahkan ke dalam media pada berbagai tahap perkembangan kultur ( media inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran). • Penambahan arang aktif dapat membantu pertumbuhan perkembangan kultur, tergantung dari jenis kulturnya • Arang aktif ditambahkan dengan konsentrasi yang bervariasi yakni 0.5-6 %

Fungsi Arang Aktif sbb: • Mengadsorpsi persenyawaan-persenyawaan toxic yang terdapat dalam media yang dapat menghambat pertumbuhan kultur, seperti : • Persenyawaan-persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka waktu inisiasi. • Persenyawaan 5-hidroksimetil furfural yang diduga terbentuk dari gula yang berada dalam larutan asam lemah dan mengalami pemanasan dengan tekanan tinggi

Mengadsorpsi zat pengatur tumbuhsehingga: • Mencegah pertumbuhan kalus yang tidak diinginkan, seperti dalam androgenesis dan pucuk yang ingin diakarkan. • Membantu embryogenesis kultur dalam media regenerasi tanpa auksin, mungkin dengan bertindak sebagai sink yang menarik auksin dari dalam sel sehingga embryogenesis dapat terjadi • Merangsang perakaran dengan mengurangi tingkat cahaya yang sampai ke bagian eksplan yang terdapat dalam media

Buffer (Chelating Agen) • Penambahan asam amino seringkali juga bersifat sebagai buffer organik. • Fe SO4 dan Na-EDTA • Penambahan KH2PO4 sendiri tidak efektif sebagai buffer.

Senyawa Organik Komplek Alamiah Bahan-bahan yang terkandung dalam air kelapa, a l: as amino, as organik, as nukleat, purin, gula, gula alkohol, vit, mineral, dan ZPT • Air Kelapa 2. Juice Tomat & Ekstrak Pisang • Banyak digunakan untuk kultur embrio anggrek. • Sumber gula, vitamin, ZPT, dan asam amino.

3. Casein Hydrolysate • Dalam kultur jagung, penambahan ekstrak ragi 800 mg/l atau casein hydrolysate 200 mg/l memperbaiki pertumbuhan kalus, • Penambahan casein hydrolysate dalam media regenerasi padi, meningkatkan jumlah pucuk yang terbentuk dalam kalus padi.

4. Ekstrak ragi • Ekstrak ragi menyumbangkan asam amino, peptida, vitamin, untuk pertumbuhan kultur. • Konsentrasi yang digunakan dalam kultur berkisar antara 0.5 - 2 gram/l. 5. Ekstrak kentang • Digunakan dalam kultur anther padi  meningkatkan pertumbuhan kalus dan regenerasi anther • Ekstrak kentang biasanya digunakan setara 10-30 % dengan hasil terbaik 20 %. • Sumber gula, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan asam amino.

Faktor Lingkungan pH Media • Pengaturan pH selain memperhati’ kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor : • Kelarutan dari garam-garam penyusun media • Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain • Efisiensi pembekuan agar. • Sel-sel tanaman membutuhkan pH yg sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8

Kelembaban RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan Cahaya Intensitas chy yg rendah dpt mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan p’bentukan tunas dr kalus tembakau pd intesitas yg rendah. Pembentukan kalus maksimum sering terjadi pada tempat yang lebih gelap Temperatur Pertumbuhan yang optimum : 200-300C. Pertumbuhan kalus endosperm : 250C.

Media Dasar Media dasar • Murhasige dan Skoog (MS), untuk hampir semua jenis kultur, terutama tan. herbaceous. • B5, untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain. • White, sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat. • Vacin dan Went , untuk kultur jaringan anggrek. • Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel. • schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil. • Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM) • Media N6 untuk serealia terutama padi.

Penghitungan • Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per liter. • 1 molar (M) = massa molekul dalam g/l. • 1 mM = massa molekul dalam mg/l 10-3 M. • 1 µM = massa molekul dalam µg/l 10-6 M atau 10-3 mM.

Konversi dari mili molar (mM) kemg/l • contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0. • 1 M larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l. • 1 mM larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l • 1 µM larutan 2,4 D berisi 0,000221 g/l = 0,221 mg/l • Konversi dari mg/l ke mili molar (mM) Massa molekul CaCl2. 2H2O = 40.08 + 2 x 35..453 + 4 x 1.008 + 2 x 16 = 147.018 Jadi 440 mg/l CaCl2. 2H2O = 2.99 mM.

Pembuatan Media • membuat stok • Stok makro • stok mikro, • stok Fe, • stok vitamin • stok hormone2-4 minggu • pengenceran 4-8 minggu V1 = vol lar stok yg dicari M1 = konsentrasi lar stok V2 = vol medium yg akan dibuat M2 = konsentrasi yg akan dibuat V1M1 = V2M2

Makro nutrien Stok Fe Mio-inositol Stok mikro nutrien 300 ml Sukrosa Stok Vit Stok ZPT + aquades  950 ml Ukur pH 5,7-5,8 + aquades  1000 ml Skema pembuatan media Masukkan agar, masak  larut Tuang dlm botol kultur Tutup dgn kapas & alm unium foil, STERILISASI

Pengenalan laboratorium, alat & media