Заварзин В.А. канд.мед.наук

1. Применение гелевой технологии для проведения исследований в иммуногематологии. Возможные причины ошибок при практической работе. Контроль качества в иммуногематологии Заварзин В.А. канд.мед.наук

2. ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ…… ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ, раздел иммунологии, изучающий антигенные свойства клеток крови и соответствующие антитела, т. е. группы крови, а также патологические процессы, обусловленные образованием антител к антигенам клеток крови

3. АНТИГЕНЫ : • ГЛИКОПРОТЕНИНЫ, ПРОТЕИНЫ присутствуют на мембране эритроцитов • Обьеденены в системы антигенов- ГРУППЫ КРОВИ • ABO • Система антигенов РЕЗУС • Системы антигенов (Kell, Luthéran, Duffy etc…)

4. История открытий групп крови…… 1900-02 – Система АВО (Ландштейнер) 1927 - Система MNS (Ландштейнер+Левин) 1940- Система Резус 1945- Система Лютеран 1946- Система Левис 1946- Система Кидд 1950- Система Даффи 1951- Система Кидд

5. Группы крови • Согласно классификации и номенклатуре ISBT выделяют: • 33 группы крови (системы антигенов) • 500 антигенных детерминант

6. Группы крови

7. Шкала приоритета трансфузионно опасных антигенов эритроцитов А,В>D>K>c>C>E>e

8. Реакция АГ-АТ • Антигены на поверхности эритроцитов(Human Red Blood Cells (HRBCs)), такжетромбоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов • Антителавсыворотке/плазме

9. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ • 2 ТИПА ИССЛЕДОВАНИЙ : • Типирование антигенови идентификация: • Agна поверхности HRBCs + Специфические известные АТ : • АГГЛЮТИНАЦИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОГО АГ • Скрининг антител и идентификация : • Известные антигены на поверхности HRBCs + сыворотка/плазма • АГГЛЮТИНАЦИЯОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОГО АТ

10. Области применения ИГ тестов • Предтрансфузионная диагностика • Не переливать гемокомпоненты без исследования антител в сыворотке реципиентов • Профилактика иммунизации по антигенам эритроцитов • Снизить риск посттрансфузионных осложнений • Профилактика и диагностика ГБН- Haemolytic Disease of the Newborn (H.D.N.)

11. Перечень исследований в иммуногематологии • Типирование групп крови по системе АВО • ПЕРЕКРЕСТНЫЙ МЕТОД • Определение Резус-принадлежности • Определение вариантов антигена D у доноров, беременных иноворожденных • Rh-Kell Фенотипирование • Анти-C, E, c, e, Анти-Kell • Типирование по антигенам • Анти JK, FY, MNS,LE... • Скрининг антител и идентификация • Постановка пробы на совместимость • Прямой антиглобулиновый тест

12. Методы иммуногематологических исследований

13. Техникидля проведения исследований в иммуногематологии • Определение на плоскости • Определение в пробирках • Микропланшеты • Гелевая технология

14. Основные методы исследований в иммуногематологии

15. 1 капля суспензии эритроцитов 1 капля реагента Neg + Смешиваем, инк. 3 мин 22 °C IgM 37 °C IgG Pos Определение на плоскости

16. Пробирки Центрифугируем 1 мин при 450 g 1 капля Суспензии эритроцитов 1 капля реагента Смешиваем Инкубируем (IgG) при 37 °C Акккуратно встряхиваем, ресуспендируем взвесь Считываем Результат реакции

17. Иммуногематологические (ИГ) методы, используемые в клинической практике • Агглютинация на плоскости • Изогемаглютинирующие сыворотки • Моноклональные антитела • Существующие проблемы тестов на плоскости: • Варьирующее качество реагентов, в том числе по сериям • Отсутствие объективной регистрации результатов и хранения результатов • Потенциально риск ошибок, связанных с ручным выполнением теста • Риски инфекционной безопасности персонала и др. • Агглютинация в пробирках • Агглютинация в микропланшетах (объективная регистрация результатов, возможность автоматизации)

18. Проблемы традиционных методов иммуногематологических исследований • 1. Объем трудозатрат, невозможность автоматизации • 2. Навык чтения результатов => субъективность в интерпретации слабо-положительных результатов • 3. Нестабильность агглютиационной картины • 4. Критическая фаза отмывки, ложные слабо-положит./отрицательные результаты. • 5. Агглютинационная картина нестабильна, возможно деградация положит. результата • 6. Вариабельность результатов, полученных различными исполнителями • 7.Вариабельность между лабораториями

19. Сильное влияние условий проведения теста • Процесс гемагглютинации зависит от следующих факторов : • рH • Температура окружающей среды • Ионная сила • Время инкубации • Соотношение концентраций Аг-Ат • Молекулярные характеристики Аг, титра антител • Физико-химические факторы, препятствующие «слипанию» эритроцитов Достоверность и воспроизводимость результата ???

20. MИКРОПЛАНШЕТНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ • Основные этапы исследования • приготовление 2 % суспензии эритроцитов в бромелине • РазведениеАнти-A, -B , -D реагентов • Раскапывание в микропланшеты • Центрифугирование • Считывание

21. МИКРОПЛАНШЕТНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ • ПРЕИМУЩЕСТВА • 96 луночный формат микропланшет • Перекрестный метод для 16 образцов • одновременная постановка • Бромелин для усиления реакции • Микрообьемы реагентов = cost effectiveness • Возможность автоматического считывания результатов

22. Исследование антител

23. Классы иммуноглобулинов: • КлассМолекулярная масса • Иммуноглобулин A (IgA) 160,000 • Иммуноглобулин D (IgD) 180,000 • Иммуноглобулин E (IgE) 200,000 • Иммуноглобулин G (IgG) 150,000 • Иммуноглобулин M (IgM) 900,000

24. Схематическое строение молекул IgG и IgM

25. ХарактермстикаIgGкласса антител Структура Т-ра РЕАКЦИИ Плацента Активация комплемента (C’) Клиническое значение Мономер Теповые: реагируют при 37oC Могут проникать через плаценту В зависимости от субкласса антител Клинически значимые антитела (результат иммунизации)

26. ХарактеристикаIgMкласса антител Структура Температура реакции Плацента Комплемент Клиническое значение Пентамер Холодовые: реагируют при 4-10oC Не проникают через плацентарный барьер ХОРОШИЕ (как правило) активаторы комплемента Несовместимость по АВО очень опасна Холодовые IgM“Обычно”НЕ имеют клинического значения.

27. КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИТЕЛ АЛЛО-АНТИТЕЛА : Иммунизация чужеродными антигенами (беременность, либо трансфузия) АУТО-АНТИТЕЛА : • Нацелены на собственные эритроциты человека. • Причина возникновения аутоимунных заболеваний(Гемолитическая Анемия). • Эти антитела могут реагировать в при различных условиях 18-25°C /37°C , что может привести к ошибкам при определении группы крови

28. КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИТЕЛ • Регулярные антитела • Естественные антитела • Регулярно присутствуют в плазме • Не сформированы в результате иммунизации (класс антителIgM) • Анти-А и Анти-В антитела • Нерегулярные антитела • Иммунные антитела • Вырабатываются в результате иммунизации (гемотрансфузии либо беременность)

29. Антиглобулиновый тест (Проба Кумбса) АГР может быть : Полиспецифическим Анти-комплементарным Анти-IgG

30. Антиглобулиновый тест (Проба Кумбса) IgG + Анти -IgG

31. Антиглобулиновый тест (Проба Кумбса) Комплемент + Анти- C3

32. Центрифугируем 1 минпри 450 g 1 капля суспензии эритроцитов 1 капля реагента Добавляем 1каплю AHG Mix Инкубируем 45 минут 37 °C Аккуратно встряхиваем, Ресуспендируя клет. взвесь Проба Кумбса (Непрямой антиглобулиновый тест -I.A.T) Интерпретируем результат Промываем3 - 4 раза В физ.ра-ре

33. Влияние промывки Неэффективная промывка Нет агглютинации

34. ПРОЦЕДУРА ПРОМЫВКИ – критическая фаза: Обязательно проводится перед добавлением антиглобулинового реагента в традиционных методах. Неправильная или неэффективная промывкавсегда неблагоприятно влияет на результат Проблемы традиционных технологий

35. Промывка - критическая стадия традиционных технологий Влияние ошибок промывки : Низкоавидные иммуноглобулины связанные с эритроцитами могут эллюироваться в ходе промывки. Чрезмерное ресуспендированиеможет разрушить агглютинацию на стадии «формирования мостиков» при слабо положительной реакции. Длительность промывки должна быть как можно более короткой– снизить вероятность эллюации антител.

36. Слишком большой остаточный объемможет снижать концентрацию АЧГ и соответственно снизить чувствительность реакции. Возможна потеря клетокпри удалении надосадочной жидкости. Слабое закисление буфера(рH < 7.2)может увеличить эллюацию антител во время процедуры отмывки.Особенно важно в случае использования моноклонального АЧГ, когда границы оптимального рН – очень узкие Возможна бактериальная контаминация промывочного буфера, что может вызывать ложно-положительный результат. Промывка - критическая стадия традиционных технологий

37. Различия в технологическом исполнении методик может оказывать влияние на достоверность и воспроизводимость результатов Высокая степень варибельности наблюдаетсяпри приготовлении эритроцитарной суспензии Чрезмерное ресуспендирование может разрушить агглютинатыв случае слабо пложительной реакции. Результат агглютинации не стабилен – интерпретировать результат НЕМЕДЛЕННО! Таким образом …еще проблемы традиционных технологий

38. Твердофазная микропланшетная технология

39. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИТЕЛ Наиболее чувствительный метод- антиглобулиновый тест – предназначен для скрининга и идентификации клинически значимых антител, постановки пробы на совместимость гемокомпонентов донор-реципиент

40. Добавление эритроцитов

41. Добавление сыворотки

42. Центрифугирование 10 мин.

43. Принцип градиентной седиментаци при центрифугировании в геле «НЕТ ПРОМЫВКИ» Способность гелевой технологии отделять эритроциты от окружающей их жидкой фазы позволяет проводить антиглобулиновый тест без процедуры промывки Для осаждения белков (несвязанныеIgG) необходимо ускорение значительно большее, чем 85 g Гелевый матрикс Центрифугирование при 85g ± 1 Минимальное ускорение требующиеся для седиментации эритроцитов 80 g в течение 10 Мин.

44. Скрининг и идентификация антител (гелевая технология) ID-карта ЛИСС/Кумбс ID-карта Кумбс Анти-IgG ID-карта NaCI, ферментный тест, холодовые агглютинины

45. СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИТЕЛ ID-карта LISS/Coombs ID-DiaCell l-ll-lll + ID-DiaPanel +

46. «Золотой стандарт» иммуногематологии • В 1980-е метод разработан Dr. YvesLapierre • В 1988 г. запатентован компанией ДиаМед (с 2007 года подразделение Bio-Rad Laboratories) • Более 500 млн. карточек • 4 млрд. тестов

47. Применение метода гель-фильтрации в клинической практике 1. Быстрое и точное определение группы крови, резус-принадлежности, в том числе в сложных случаях 2. Широкое типирование антигенов эритроцитов всех известных систем 3. Скрининг и идентификация аллоантиэритроцитарных антител 4. Индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания 5. Диагностика посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных 6. Определение редких антигенов (до 82 различных профилей исследований)

48. Основные группы тестов • Определение группы крови по системе АВО • Прямой и перекрестный метод, подгрупп(доноры, реципиенты и, беременные, новорожденные) • Определение антигена D системы Резус • Определение резус-принадлежности (доноры, реципиенты, беременные, новорожденные) • Выявление вариантных антигенов и (доноры, беременные, новорожденные) • Фенотипирование Rh-Kell • Определение антигенов С, с, Е, е, К (доноры эритроцитсодержащих гемокомпонентов, некоторые группы реципиентов) • Скриннинг и идентификация антиэритроцитарных антител • Непрямой метод Кумбса (доноры, реципиенты, беременные) • Проба на совместимость • Непрямой метод Кумбса (доноры, реципиенты) • Определение АТ на поверхности эритроцитов: • Прямая проба Кумбса (новорожденные, реципиенты)

49. Гелевая технология Основана на комбинации методов: АГГЛЮТИНАЦИЯ + ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ =ID технология Выполнение всего комплекса иммуногематологических исследований

50. Метод агглютинации и гель-фильтрации Карточка включает6 пробирок, заполненных полиакриламиднымгелем, содержащиммоноклональныеантитела