Genômica funcional e metagenômica

1. Discentes:Dayane Andrade dos Reis Fernanda M. de Oliveira Henriette G. Moranza Docentes: Prof.Dr.Jesus A. Ferro Prof. Dr. Marcos Tulio Genômica funcional e metagenômica

2. A genômica é a ciência que estuda o genoma dos organismos a partir do seu sequenciamento completo, com o objetivo de entender a sua estrutura, organização e função. • GenômicaEstrutural: determina a sequência de nucleotídeos de um genoma. Estuda a organização e estrutura dos genes, refere-se aos dados do sequenciamentode DNA; • Genômica Funcional: Genômica funcional é um campo da biologia molecular que descreve a função de genes e proteínas. Basicamente, a função de um gene é determinada quando são identificados os seus respectivos produtos gênicos. GENÔMICA

3. GENÔMICA FUNCIONAL Transcriptômica Proteômica Metabolômica RNAi Knockouts

5. •Transcriptoma ou Transcritoma refere-se ao conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. • Para estudar o transcriptoma os pesquisadores utilizam métodos de análise em grande escala como: • SAGE (analise serial da expressão gênica); • Microarrays (microarranjos de cDNA); • RNAseq. TRANSCRIPTôMICA

6. SAGE (analise serial da expressão gênica) é uma técnica para quantificar em larga escala a expressão de genes de uma dada população de RNAs mensageiros. Esta técnica gera etiquetas (tags) de cDNA que são ligadas e seqüenciadas para, em seguida, serem analisadas e anotadas. sage

7. A técnica de analise em larga escala conhecida como microarrays ou chips de DNA, permite uma visão global na busca de padrões de expressão gênica em amostras biológicas; Por meio da determinação da expressão de milhares de genes simultaneamente, esta tecnologia permite a comparação entre comportamentos moleculares de diversos tipos de linhagens e tecidos diferentes; Microarrays

8. RNA-Seq envolve seqüenciamento de cDNAs (DNA complementar), obtidos a partir da ação da enzima transcriptase reversa sobre RNAs mensageiros, utilizando tecnologias de seqüenciamento com alto rendimento; Permite: medição dos níveis de transcritos e determinar a estrutura funcional dos genes; Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade; Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutações, indels, splicing alternativos; Rna SEQ

9. É uma maneira relativamente simples e rápida de inativar o gene e assim compreender as funções destes; Esse método explora o mecanismo natural usado em várias plantas, animais, fungos e protozoários para se proteger contra certos vírus e elementos transponíveis; Rna de interferênciA

10. Introduz uma molécula dupla fita de RNA, cuja sequência de aminoácidos combina com a parte do gene a ser inativado em uma célula ou organismo; Depois que o RNA é processados ele hibridiza com o mRNA produzido pelo gene alvo e o direciona para degradação.

11. O nocaute  ou inativação de um gene é uma técnica genética que consiste em bloquear a expressão de um gene específico num organismo, substituindo o gene original em seu locus por uma versão modificada do mesmo, à qual se extraiu um ou vários exões para gerar uma versão não funcional, incapaz de produzir a proteína que codificava o gene original. O objetivo desta técnica é deduzir a atividade de um gene ou o papel biológico deste, com base em um fenótipo mutante. Knockout

13. O termo proteômica foi introduzido em 1995 para descrever todas as proteínas que são expressas em um genoma (Anderson et al., 1996; Wilkins et al., 1996); • Atualmente, proteômica é descrita como um método direto para identificar, quantificar e estudar as modificações pós-traducionais das proteínas em uma célula, tecido ou mesmo organismos. • Não é uma característica fixa • se altera com o desenvolvimento do tecido ou sob as condições em que o indivíduo se encontra; PROTEÔMICA

14. Fundamenta-se em princípios bioquímicos, biofísicos e de bioinformática para quantificar e identificar as proteínas expressas;

15. 2 técnicas utilizadas para análise: • Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2DE) • Separação, detecção e quantificação de proteínas • Espectrometria de massa • Identificação das proteínas através da bioinformática Técnicas Aplicadas ao Estudo da Proteômica

16. Introduzida na década de 70 • A 2DE combina duas técnicas de separação: • a primeira separação (primeira dimensão) • Focalização isoelétrica (IEF) • a segunda dimensão (2DE) • Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Eletroforese Bidimensional (2DE)

17. No IEF, as proteínas são separadas por alta tensão em um gradiente de pH imobilizado em um gel de acrilamida até alcançarem a posição estacionária, onde a carga total é zero (pI). • Na 2DE, as proteínas são separadas pelo peso molecular, também através de uma tensão, em gel de poliacrilamida. • Após a coloração do gel, observa-se um perfil bidimensional de pontos (“spots”), sendo que em cada ponto há múltiplas cópias de uma proteína. A imagem deste perfil é posteriormente analisada através da bioinformática.

19. Algumas limitações: • proteínas muito ácidas (pH menor que 3,5) ou básicas (pH maior que 9) • proteínas de baixa abundância • proteínas hidrofóbicas • No geral, a 2DE é um método de separação eficiente, pois todas as proteínas da amostra são separadas simultaneamente, fornecendo informações úteis: • pI, massa molecular, expressão, abundância relativa e modificações pós-traducionais

20. Uma das técnicas mais utilizadas para a identificação das proteínas é a análise do “fingerprinting” da massa precisa de um número de peptídios derivados da mesma proteína Identificação das Proteínas

22. Se refere ao conjunto de todos os metabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo. • Compreende uma grande variedade de compostos químicos de baixa massa molecular (<1000 Da), que apresentam propriedades químicas diversas; • De espécies iônicas a carboidratos hidrofílicos, álcoois e cetonas voláteis, aminoácidos e ácidos orgânicos, lipídeos hidrofóbicos e produtos naturais complexos. • Os níveis dos metabólitos representam uma informação integrativa da função molecular, definindo assim o fenótipo de uma célula ou tecido, em resposta a alterações ambientais ou genéticas. • A identificação desses níveis é um complemento fundamental na determinação da função gênica Metabolômica

23. Diferencialmente dos RNAs e proteínas, é muito difícil estabelecer ligação direta entre genes e metabólitos; Análise é mais complexa; Como um metabólito pode participar de diversas vias metabólicas e os intermediários metabólicos apresentam vida muito curta, a interpretação dos dados metabolômicos é dificultosa. Desafios

24. Envolve a determinação dos níveis ou concentrações de compostos químicos de baixa massa molecular e que estejam presentes dentro e/ou fora das células. • Do ponto de vista analítico, há basicamente duas abordagens principais para a análise do metaboloma: • Análise Direcionada: determinação de um grupo de metabólitos pré-definidos, ignorando outros que sejam detectados durante a análise; • Perfil Metabólico: conjunto de todos os metabólitos ou produto derivado e que sejam detectáveis durante a análise, acompanhando por uma estimativa de quantidade (absoluta ou relativa). Análise do Metaboloma

26. Passo 1: Interrupção rápida do metabolismo (quenching) por alterações na temperatura ou pH. • Passo 2: Separação da biomassa celular do meio de cultura; • Passo 3: Concentração das amostras, por extração seletiva ou evaporação a vácuo de solventes Preparação das amostras

28. Métodos mais usados para detecção e análise: • Espectrometria de massa • Alta sensibilidade e praticidade, possibilidade de se confirmar identidade de componentes e identificação de compostos desconhecidos • Ressonância Magnética Nuclear • Util na caracterização estrutural de compostos desconhecidos. • Mais caro Análise dos Metabólitos

29. Metagenômica

30. Metagenômica: é a análise genômica das comunidades de microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo; Metagenoma: é o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat. definição

32. Saúde humana Aplicações

33. Bioenergia APLICAÇÕES

34. Agricultura APLICAÇÕES

35. Biorremediação APLICAÇÕES

36. Metabolismo animal APLICAÇÕES

37. Identificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicas; • Estimar a diversidade microbiana; permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todo; • Compreender a dinâmica da população de uma comunidade inteira. PROJETOS METAGENÔMICOS

38. Amostrasdevemrepresentar a população→ Quantasamostrassãonecessárias? Curvas de raridadeparaestimarfração de espéciessequenciadas. (Abundância x Complexidade). • Presença de populaçõesdominantesafetaanálises → representaçãomaior e maior chance de montarcontigs. • Quantomaismetadadosforemcoletadosmaisdetalhadasserão as inferências das condiçõesambientais. Ex.: dados geográficos, bioquímicos, data de coleta, métodos de extração do DNA. Desafios de amostragem

39. Métodos tradicionais: • Genes marcadores (16S rRNA, recA) • Sequenciamento (Sanger, pirosequenciamento) • Técnicas de fingerprint (T-RFLP, DGGE) • Metagênomica: • Melhor representação da composição taxonômica • Aspectos funcionais

40. Necessidade de se obter grande número de sequências • Novas plataformas de sequenciamento: • 454 (Roche), SOLiD (AppliedBiosystems), GenomeAnalyzer (Illumina) • Obtenção de sequências em larga-escala • Favorece estudos metagenômicos

41. Terragenome PROJETOS ATUAIS “We know more about the movement of celestial bodies than about the soil underfoot.” -Leonardo da Vinci

42. Global OceanSampling (GOS) Projetos atuais Fonte: http://camera.calit2.net/about/gos.shtm

43. Estudo de caso

44. Genoma da Apismellifera já sequenciado – GenBank;

45. Análise em larga escala da expressão gênica em diferentes fases do ciclo de vida da abelha; • Identificação dos genes envolvidos no: • Desenvolvimento de castas • Ativação dos ovários em rainhas e operárias • Ciclo funcional das glândulas hipofaríngeas • Determinação do sexo nas fases iniciais da embriogênese

46. 2 estratégias no projeto:  1) Identificação de genes candidatos no genoma da abelha a partir do conhecimento prévio da função destes genes em outros organismos, especialmente os atributos do Gene Ontology registrados no Flybase

47. 2)  Busca e análise de novos genes através de microarrays, por estratégias de hibridização subtrativa e pela construção de uma biblioteca de cDNA das fases embrionárias. A expressão diferencial destes genes foi avaliada e candidatos de interesse foram investigados com mais detalhe por RT-PCR quantitativa e silenciamento por RNAi. O conjunto das informações geradas foi submetido a análises de redes gênicas para revelar possíveis conexões e a organização em redes funcionais.

48. Obrigada!