Biosensores

1. Biosensores “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación”

2. BIOSENSORES • Utilizan la especificidad de los procesos biológicos: • Enzimas x Sustratos • Anticuerpos x Antígenos • Lectinas x Carbohidratos • Complementariedad de ácidos nucleicos. • Ventajas: • Reutilización • Menor manipulación • Menor tiempo de ensayo • Repetitividad • Tipos y usos mas comercializados: • Tiras colorimétricas • Electroquímicos: • Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol, Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos, Colesterol • Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol • Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.

3. Propiedades de un buen Biosensor

5. BIOSENSORES • Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas. • Consultas y Urgencias Hospitalarias: • Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales • Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento • Menor riesgo de deterioro de la muestra • Diagnóstico Doméstico: • Ensayos de Embarazos • Control de Glucosa en diabéticos • Aplicaciones in vivo: • Páncreas artificial • Corrección de niveles de metabolitos • Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad • Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales: • Alimentación • Cosmética • Control de Fermentaciones • Controles de Calidad • Detección de Explosivos • Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas • Control de polución.

6. TIPOS DE BIOSENSORES • BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS • Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox • Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones • Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones • BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS • BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS • BIOSENSORES ÓPTICOS • De onda envanescente • Resonancia de plasma superficial • BIOSENSORES CELULARES • INMUNOSENSORES

7. UNIDADES FUNCIONALESDE UN BIOSENSOR

8. Material biológico + Analito Analito unido Respuesta biológica Respuesta Electrónica Respuesta electrónica (Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito) = (Constante de semisaturación) + (Concentración del analito)

9. Cinéticas de reacción en biosensores

10. TIPOS DE BIOSENSORES • BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS • Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox • Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones • Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones • BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS • BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS • BIOSENSORES ÓPTICOS • De onda envanescente • Resonancia de plasma superficial • BIOSENSORES CELULARES • INMUNOSENSORES

11. Biosensores Electroquímicos Amperométricos:“El electrodo de Oxígeno”

12. Electrodo de Oxígeno

13. Electrodo de Oxígeno (A) Disco de resina epoxy (B) Cátodo de platino en el centro de un saliente. (C) Ánodo de plata en forma circular (D) Anillo de goma que sostiene un papel espaciador empapado en un electrolito y una membrana de polytetrafluoroethylene que separa los electrodos de la mezcla de reacción.

14. DETERMINACION DE GLUCOSA

15. DETERMINACION DE GLUCOSA

16. Invertasa Glucosa-oxidasa Glucosa Sacarosa Electrodo O2 Fructosa Glucosa D-gluconolactona H2O2 respuesta glucosa sacarosa tiempo DETERMINACION DE SACAROSA flujo

17. DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de reacciones de degradación progresiva: ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico

18. DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO BIOSENSOR: xantina-oxidasa y nucleósdio fosforilasa inmovilizadas sobre una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de Oxígeno. K < 20 El pescado puede ser comido crudo. 20 > K < 40 El pescado debe ser cocinado. K > 40 Pescado no apto para el consumo Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa

19. Varios mecanismos redox

20. Mediadores redox en biosensores amperométricos

21. Miniaturización Posible por la capacidad del pirrol para polimerizar mediante oxidaciones electroquímicas en condiciones suficientemente suaves como para atrapar enzimas y mediadores sin desnaturalizarlos

22. Microelectrodo glucosa/lactato Se puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de micro fabricación de microprocesadores, en incluso disponiendo varios sensores en los mismos

23. Biosensores Electroquímicos Potenciométricos Determinan cambios en la concentración de iones concretos

24. Biosensores potenciométricos

25. Biosensor potenciométrico

26. Biosensores Electroquímicos Conductimétricos Detectan cambios en conductividad eléctrica causados por alteraciones en la concentración de iones

27. NH2CONH2 +3H2O Ureasa 2HN 4+ + HCO3- + OH- Sensor de Urea Otros ejemplos: amidasas, decarboxilasas, esterasas, fosfatasas y nucleasas.

28. Biosensores Termométricos:“Sensores bioquímicos y TELISA”

29. Biosensor termométrico Precisa un aislamiento Correcto Puede detectar diferencias de 0,0001 ºC

30. Reacciones usadas en biosensores termométricos

31. Biosensores Termométricos • Poco éxito comercial • Ventaja: se puede acoplar fácilmente varias reacciones en un único reactor • Ejemplo: • Detector de Lactato Lactato + O2------(lactato -oxidasa)---> piruvato + H2O Piruvato + NADH+ H+--(lactato deshidrogenasa)--> lactato + NAD+ • Puede utilizarse células viables • Puede acoplarse a un inmunoensayo enzimático: ELISA termométrico o TELISA

32. Biosensores Piezoeléctricos:“Narices bioelectrónicas” • Aprovechan las propiedades eléctricas de los cristales: • En transmisores y emisores de radio • En transistores • En chips

33. Efecto Piezoeléctrico “Producción de un campo eléctrico por separación de las cargas positivas y negativas en algunos tipos de cristales al someterlos a ciertas tensiones” Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo eléctrico se deformará. 2) Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo eléctrico que oscila a una frecuencia determinada vibrará con una frecuencia característica.

34. Efecto Piezoeléctrico • La frecuencia de resonancia se encuentra en el rango de los 10 MHz (radiofrecuencia). • La frecuencia de resonancia depende de: • La composición del cristal • El Grosor • La forma en que fue cortado 3) Un cristal piezoeléctrico varía su frecuencia de resonancia cuando se adhieren moléculas a su superficie.

35. Biosensores Piezoeléctricos • Se detectan variaciones muy pequeñas en la frecuencia de resonancia: cantidades de hasta un ngr/cm2 • La medida se compra con un electrodo de referencia con cristal sin material biológico. • Ejemplos: • Detectores gaseosos: SO2, CO, HCl, NH3, CO2 • Detector de Cocaina • Detector de Formaldehido • Detector de Pesticidas (Organofosforados)

36. Biosensores Piezoeléctricos • Detector de Cocaína: • Anticuerpos contra cocaína fijados sobre un cristal piezoeléctrico. • Detecta una parte por billón • 50 MHz de cambio en la frecuencia de resonancia. • Se limpia en segundos por aireación.

37. Biosensores Piezoeléctricos 2) Detector de Formaldehido: CH2 +H2O +NAD+ gNADH +HC02H + H2 Catalizada por la formaldehido deshidrogenasa inmovilizada con glutation (cofactor) por entrecruzamiento con glutaraldehido en un cristal de cuarzo a 9 MHz

38. Biosensores Piezoeléctricos 3) Detector de Pesticidas Organofosforados: • Colinesterasa inmovilizada en un cristal de cuarzo mediante glutaraldehido.

39. Biosensores Piezoeléctricos Inconvenientes: • Muy influidos por la humedad. Baja = poco sensibles Alta = desaparece el efecto piezoelectrico • Inutilizables en líquidos. Introducir y secar

40. Biosensores Ópticos: • Permiten el uso de materiales detectores no eléctricos, seguros en ambientes peligrosos o sensibles (in vivo) • No precisan sensores de referencia

41. Biosensor de fibra óptica para lactato • Detecta cambios en la en la concentración de oxígeno determinando la reducción de la fluorescencia de un fluorocromo (quenching)

42. Biosensor de célula óptica para albúmina sérica • Detecta la absorción de luz a 630 nm que pasa a través de la célula detectora. • Se evalúa el cambio de amarillo a azul verdoso del verde de bromocresol cuando se une a la albúmina sérica a pH 3.8 • Respuesta lineal a la albúmina en un intervalo de 5 a 35 mg/cm3

43. Biosensores Ópticos • Detección de Vapores: • Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y 2,6-diclorindofenol sólidos dispersados sobre placas de TLC (cromatografía en capa fina) de celulosa microcristalina transparente. • Tiras colorimétricas de un solo uso: • Los más utilizados: análisis de sangre y orina. • Control de la glucemia en diabéticos • Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un cromógeno que cambia el color al ser oxidado Cromógeno (2H) + H2O2----(peroxidasa)--->colorante + 2H2O

44. Biosensores Ópticos 3) Reacciones luminiscentes: • Utilización de luciferasa • Detecta la presencia de microorganismos en orina al liberar ATP en su destrucción Luciferina + ATP----(luciferasa)---> oxiluciferina + CO2 + AMP + ppi + luz

45. Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > Biosensores ópticos de onda evanescente “Un haz de luz será reflejado en su totalidad cuando incida sobre una superficie transparente presente entre dos medios, cuando proceda del medio con mayor índice de refracción y cuando el ángulo de incidencia sea mayor que un valor critico”

46. Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > Biosensores ópticos de onda evanescente “En el punto donde se produce la reflexión, se induce un campo electromagnético que penetra en el medio que tiene menor índice de refracción” “Este campo es denominado onda evanescente y decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros”

47. Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > Biosensores ópticos de onda evanescente “La onda evanescente decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros” “La profundidad a la que penetra depende del índice de refracción, de la longitud de onda de la luz utilizada y puede ser controlada con el ángulo de incidencia.

48. Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > Biosensores ópticos de onda evanescente “La onda evanescente puede interaccionar a su vez con el medio, provocando un campo electromagnético que puede volver al medio con mayor índice de refracción, dando lugar a cambios en la luz que continúa a lo largo de la guía de ondas.”

49. Inmunosensor de onda evanescente • Especialmente indicados para inmunoensayos: • No es necesario separar el resto de los componentes de una muestra clínica • La onda solo penetra hasta el complejo antígeno anticuerpo • Se excitan fluorocromos unidos a la superficie mediante la onda evanescente, y la luz emitida por ellos volverá a la fibra óptica • La cantidad de muestra necesaria es mínima

50. Resonancia de plasma superficial “Si la superficie del cristal está recubierta por una capa metálica (oro, plata, paladio) los electrones de su superficie pueden oscilar en resonancia con los fotones generando un onda de plasma superficial y amplificando el campo evanescente en la cara mas alejada del metal”