Ŏhukese kihi kromatograafia ja gaasikromatograafia

1. Ŏhukese kihi kromatograafia ja gaasikromatograafia

2. ŎHUKESE KIHI KROMATOGRAAFIA • Vedelikkromatograafilisi analüüse ei viida läbi ainult kolonnides, vaid ka plaatidel. • Plaadi materjal vŏib ise olla kandjaks läbiviidavas kromatograafilises protsessis (paberkromatograafia). • Klaasist, metallist vŏi sünteetilisest materialist plaadile kantakse ŏhukese kihina statsionaarne faas. • Liikuva faasina kasutatav vedelik liigub plaadi pinnal kapillaarjŏudude mŏjul. Kasutatakse ka gravitatsioonijŏudu, elektrivälja tugevust, • Kŏige levinum planaarse kromatograafia esindajaid on ŏhukese kihi kromatograafia. • Peamised eelised – lihtne opereerida, nŏuab vähe vahendeid, odav ja kiire • Peamised puudused – raske automatiseerida, ei vŏimalda saada suurt lahutuvust • Peamine kasutusala – andmete esmane läbisŏelumine tööstuslikes, kliinilistes, farmatseutilistes ja biokeemilistes laborites.

3. Statsionaarsed faasid • Ŏhukese kihi kromatograafias kasutatakse samu statsionaarseid faase kui kolonn-kromatograafiaski. Need materialid kantakse peente teradene lamedatele plaatidele, mille dimensioonid on enamsti 5x10, 10x20 vŏi 20x20 cm. Kihi paksus on enamasti 200 kuni 250 m. Osakeste diameeter on 20 m vŏi suurem. Taldrikute arv vŏib ulatuda kuni 200-ni (vedeliku liikumisel 25 minuti jooksul üle 12 cm ala). • Viimased arengud ŎKK vallas vŏimaldavad saada kuni 4000 teoreetilist taldrikut. Analüüsi aeg 10 min, tee pikkus 3 cm. Sellise tulemuse teeb vŏimalikuks osakeste väike diameeter (5 m vŏi vähem) ja statsionaarse faasi väike paksus (100 m). Meetodi puuduseks on analüüsitavate ainete väike kogus.

4. Proovi pealekandmine ja lahutuse läbiviimine • Analüüdi kontsentratsioon peab moodustama 0.01 –0.1% proovi kontsentratsioonist. • Ruumalad on enamasti vahemikus 0.5 – 5 l. • Proovi tilga diameeter: 5 m (kvalitatiivse analüüsi puhul). Alla 5 m kvantitatiivse analüüsi korral. • Proovi pealekandmiseks kasutatakse kapillaare. • Suuri effektiivsusi vŏimaldava süsteemi korral on proovi hulk 100-200 nl. • Asukoht: 1-2 cm plaadi servast. • Proovilahuse solvent aurutatakse ära enne kromatograafilise protsessi algust.

5. Kromatogrammi saamine • Et saada kromatogrammi peab liikuv faas liikuma üle statsionaarse faasi. Selleks paigutatakse plaat statsionaarse faasiga ŏhukindlalt suletavasse kambrikesse. Nimetatud kambrike küllastatakse liikuva faasi aurudega. Plaadi alumine ots pannakse vedela liikuva faasi sisse. Oluline on jälgida, et proov ei “upuks” liikuvasse faasi. Liikuv faas ronib kapillaarjŏudude mŏjul mööda plaati üles, aga mitte konstantse kiirusega – kiirus väheneb kŏrguse kasvades hüperboolse funktsiooni järgi. Kui liikuv faas on katnud 2/3 plaadi pikkusest, siis vŏetakse plaat vedelikust välja ja kromatograafiline protsess on seega lŏppenud. Plaadil lastakse kuivada ja seejärel saab uurida proovi tsoone.

6. Detekteerimine • Proovi tsoonide lokaliseerimiseks plaadil kasutatakse järgnevaid meetodeid: • Kasutatakse ära luminesseerumise nähtust - orgaaniliste ühendid on sageli fluorestseeruvad, anorgaanilised fosforestseeruvad. • Plaadi pritsimine mittespetsiifiliste tugevate oksüdeerijatega (HNO3, KMnO4, H2SO4) – orgaanilise aine tsoonid värvuvad mustaks. • Plaadi pritsimine ainega, mis on spetsiifiline kindla aine vŏi ainete grupi suhtes (ninhüdriin NH2 suhtes, FeCl3 fenoolidele, aniliinftalaat suhkrute redutseerimiseks, jne.) • Konkreetset ainet on väga lihtne identifitseerida kui on olemas audentne vŏrdlusaine. Sellisel juhul tuleb viia läbi mŏlema proovi samaaegne kromatograafiline lahutamine ja vŏrrelda pärast analüüsi lŏppu vastavate proovitäppide asukohti, värvi ja/vŏi keemilist reaktsiooni. • UV-VIS, IR • Proovitäpi saab ka välja lŏigata ja allutada edasisele analüüsile, kasutades suvalist tuntud detekteerimismeetodit.

7. Retentsioonitegur • Rf kasutatakse ŎKK-is retentsiooni iseloomustava suurusena. Rf defineeritakse analüüdi migratsiooni pikkuse, zR, ja liikuva faasi migratsiooni pikkuse, zM, suhtena: • Rf=zR/zM • Kui proovi tsoon on sümmeetrilise täpi kujuline, siis mŏŏdetakse migratsiooni teepikkust tsooni keskpaigast. Asümmeetriliste tsoonide puhul tsooni kŏige intensiivsemast osast.

8. Mahtuvusfaktor • Kui me tahame leida süsteemi iseloomustava mahtuvusfaktori konkreetse analüüdi jaoks, peame kŏigepealt leidma aja, tM, mille vältel analüüt viibib liikuvas faasis. Selleks tuleb analüüdi poolt liigutud vahemaa, zR, jagada liikuva faasi lineaarse kiirusega, ū: • tM=zR/ū • Aja tM jooksul liigub liikuv faas vahemaa zM. Retentsiooniaeg tR avaldub järgmise seose kaudu: • tR=zM/ū • Asendades suurused tM ja tR mahtuvusfaktori k’ avaldisse • k’=(tR-tM)/tM • (kus tR on analüüdi retentsiooniaeg ja tM nn. “surnud aeg”) • saame: • k’= (zM-zR)/zR • Jagades vŏrrandi parema poole kŏik liikmed läbi zM-ga saame leida sŏltuvuse k’ ja Rf vahel: • k’ = (1-zR/zM)/(zR/zM) = (1-Rf)/Rf • Migratsiooni vahemaid saab kasutada ka toreetiliste taldrekute arvu N ja taldreku kŏrguse H arvutamiseks: • N = 16(zR/w)2 • H = zR/N

9. Rakendused • Nagu juba mainitud sobib ŎKK suure hulga proovid eelsorteerimiseks. Peale meetodi lihtsuse on siin oluliseks plussiks ka asjaolu, et korraga saab analüüsida mitut proovi. • ŎKK abil saab teha kvalitatiivset analüüsi vŏttes aluseks ainetsoonide retentsioonivahemaad. Absoluutsete Rf-ide leidmine ei ole väga paljulubav kuna see sŏltub tugevasti eksperimentaalsetest tingimustest (statsionaarse faasi kihi paksus, niiskusesisaldus liikuvas ja statsionaarses faasis, temperatuur, liikuva faasi küllastatuse aste analüüsikambris, proovitsooni suurus). Seetŏttu on kasutusele vŏetud suhteline retentsioonifaktor Rrel, mis leitakse i-nda analüüdi retentsioonifaktori Rf(i) ja standardaine retentsioonifaktori Rf(st) suhtest: • Rrel = Rf(i)/Rf(st) • Tulemuste ekraneerimiseks kasutatakse enamasti fotomeetrilisi meetodeid.

10. ŎKK vs. HPLC • Kolonn-vedelikkromatograafias hoiab pump konstantset eluendi voolukiirust. ŎKK puhul aga eluendi voolukiirus muutub analüüsi vältel. See aga pŏhjustab ainetsoonide laienemist ja seetŏttu lahutusvŏime vähenemist. Seega on lahutamiseks sobivate vahemaade pikkus limiteeritud ning seega ka teoreetiliste taldrekute arv. • Eluendi voolukiiruse muutmist ŎKK puhul saab korraldada ainult muutes statsionaarse faasi materiali vŏi eluenti ennast. • Solvendi kontsentratsioon vŏib muutuda analüüsi käigus, mis pŏhjustab nii mahtuvusfaktorite kui ka kogu analüüsi mittereprodutseeritavuse. • Osaliselt on ülaltoodud probleemidest vŏimalik üle saada avaldades eluendile täiendavat jŏudu ja kontrollides sellega eluendi liikumiskiirust.

11. Gaasikromatograafia • Gaasikromatograafias on liikuvaks faasiks gaas, liikumatuks faasiks aga tahke aine või vedelik. • Lahutatavad ained jaotuvad kandegaasi ja statsionaarse faasi vahel, kusjuures see jaotus on määratud nende ainete jaotuskonstandiga, K

12. Gaasikromatograafi blokkskeem: • 1 – kandegaasi balloon • 2 – proovi sisestusseade • 3 – termostaati paigaldatud kolonn • 4 – detektor • 5 – andmete registraator (arvuti, integraator või isekirjutaja)

13. Kandegaasid • Liikuva faasina e. kandegaasina kasutatakse inertgaase. Kasutatavad kandegaasid peavad olema: • keemiliselt inertsed (s.t. nad ei tohi reageerida analüüsitavate ainetega ega statsionaarne faasiga) • kõrge puhtusastmega (nt. ei tohi sisaldada vett ega hapnikku, mis võivad lagundada statsionaarne faasi, põhjustada kolonni lekkimist ning lõpuks täielikku rikkumist) • ühilduv kasutatava detektoriga (nt. kui on tegemist mass-spektromeetrilise detekteerimisega, siis peab kandegaasina kasutama heeliumi) • ökonoomne • ohutu • efektiivne (analüüsi aja seisukohalt) • Enamkasutatavad kandegaasid on H2, N2 ja He.

14. Pumbad • Gaasikromatograafias ei ole vaja pumpasid, kuna gaasi vool läbi süsteemi on kindlustatud gaasi silindri liigrŏhu (jääkrŏhu) tŏttu. • Voolu kontstantseks hoidmiseks kasutatakse kahekäigulisi klappe, keerulisemate analüüside puhul koos voolu regulaatoriga. • Voolukiiruse mŏŏtmiseks vŏib kasutada rotomeetrit kolonni alguses vŏi seebimulli voolumeetrit kolonni lŏpus.

15. Proovi sisestusseade • Tavaliselt on gaasikromatograafias analüüsitavad proovid enne instrumenti sisestamist vedelal kujul. • Gaasiliste proovide sisestamiseks kasutatakse dosaatoreid, mis suruvad ühteaegu kandegaasi kolonni ja proovigaasi läbi aasa õhku. • Tahkete ainete gaasikromatograafilisel analüüsil kasutatakse pürolüüsgaasikromatograafiat. • Vedelad proovid (reeglina lahustatud orgaanilises lahustis) süstitakse instrumenti süstla või klapi abil.

16. Probleemid proovide sisestamisel • Ehkki gaasikromatograafia on hästi väljaarendatud meetod ei ole proovi sisestamine siin triviaalne ülesanne. See kehtib peamiselt kapillaarkolonnide puhul. • Täidiskolonnide puhul proov lihtsalt süstitakse kuumutatud ja termostateeritud sisestusseadmesse, kus proov aurustatakse ja kantakse kandegaasi poolt kolonni. • Kapillaarkolonnide puhul tekitab probleeme nende väike ruumala (NB! 1 L vedelat proovi muutub aurustamisel mitmesajaks L auruks) • Näide: 0.2 mm läbimõõdu ja 25 m pikkusega kapillaarkolonni (küllaltki tavalised mõõdud kapillaarkolonni puhul) ruumala on väiksem kui 800 mikroliitrit.

17. Probleemi lahendused I • Probleemi lahendamiseks on välja pakutud peamiselt 2 võimalust: • Proov viiakse süstlaga sisestusseadmesse ja aurutatakse. Seejärel juhitakse suurem osa aurustunud proovist sisendseadmest välja ja ainult väikene osa viiakse kolonni. • Proov viiakse süstlaga külma sisestusseadmesse. Hoolika temperatuuri reguleerimisega aurustatakse kõigepealt lahusti, mille aurustumistemperatuur on madalam kui proovil. Seejärel aurustatakse proovi komponendid ja juhitakse kolonni.

18. Probleemi lahendused II • Esimese lähenemise eelis on see, et proov viiakse kolonni kitsa ribana. Selle seadme puudusteks on aga suured proovi kaod ja proovi komponentide diskrimineerimine masside alusel. • Nende probleemide lahendamiseks on välja töötatud nn. “külmkogumise” meetod, mis seisneb selles, et aurustunud proovil lastakse uuesti kondenseeruda koos osa solvendiga, ülejäänud solvent juhitakse sisestusseadmest välja. Seejärel tõstetakse sisendseadme temperatuuri uuesti ja aurustatud proovi komponendid juhitakse kolonni.

19. Kolonnid I • Gaasikromatograafias kasutatakse täidiskolonne ja kapillaarkolonne. • Täidiskolonnide sisediameeter on 2-4 mm ja nad on reeglina 1-6 m pikkused. Täidiskolonnid on täidetud poorse materialiga. • Sõltuvalt sellest, kas poorne täidis on statsionaarseks faasiks või ainult kandjaks statsionaarsele faasile, eristatakse • gaas-adsorptsioonkromatograafiat ja • gaas-vedelikkromatograafiat

20. Kolonnid II • Kapillaarkolonnide sisediameeter on tavaliselt vahemikus 0.1 – 0.5 mm, pikkus 5 – 100 m. Materjalina on üha rohkem kasutusel polüimiidiga kaetud kvartskapillaarid. • Statsionaarse faasina kasutatav vedelikukile kantakse 0.1 – 5 m paksuse kihina kapillaari siseseinale.

21. Statsionaarsed faasid • Statsionaarne faas gaasikromatograafias peab täitma kahte tingimust: • võimaldama eristada segu komponente ja • olema termiliselt stabiilne • Polümeersed ühendid täidavad viimast nõuet kõige paremini. Eriti stabiilsed on siloksaanid. Statsionaarse faasi selektiivsuse muutmine toimub selle modifitseerimise kaudu: • CH3-rühm annab tulemuseks vähepolaarse polümeeri, • tsüaanopropüülrühmad annavad väga polaarse polümeeri.

22. Kolonni termostaat • Termostaadi funktsiooniks on kontrollida kolonni temperatuuri täpselt ja reprodutseeritavalt.Temperatuur peab jaotuma ühtlaselt üle kogu kolonni. • Termostaat peab võimaldama ka gradiendi tekitamist ning sellele järgnevat algtemperatuuri taastamist. Viimase omaduse puudumine on sageli süstemaatilise vea allikaks.

23. Detektorid • Gaasikromatograafias on 2 tüüpi universaalseid detektoreid: soojusjuhtivusdetektor ja leek-ionisatsioondetektor. Viimasel ajal kasutatakse üha rohkem ka mass-spektromeetreid kui detektoreid. Viimased vŏimaldavad komponentide spetsifitseerimist. • Soojusjuhtivusdetektor (TCD) • Leekionisatsioondetektor (FID)

24. Soojusjuhtivusdetektor (TCD) • Selliste detektorite puhul mŏŏdetakse kandegaaside (heelium vŏi vesinik) soojusjuhtivust eksperimendi ajal. Analüüdi juuresolekul kandegaasi soojusjuhtivus langeb, kuna nimetatud gaaside soojusjuhtivus on ligikaudu 6 – 10 korda suurem kui orgaaniliste ainete soojusjuhtivus. • Kuna soojusjuhtivusdetektorid on mittespetsiifilised, saab neid kasutada nii orgaaniliste kui anorgaaniliste ainete kontsentratsiooni mŏŏtmiseks. Teiseks soojusjuhtivusdetektoritele iseloomulikuks plussiks on see, et nad ei lagunda aineid. Puudusteks on aga kŏrge detekteerimispiir (ainult 10-8 g/mL – leekionisatsioondetektoril on see suurus näiteks 10-13 g/mL ) ja kitsas lineaarne mŏŏtmispiirkond

25. Leekionisatsioondetektor (FID) • Leekionisatsioondetektor on momendil kŏige sagedamini kasutatav detektor gaasikromatograafias. Detekteerimise printsiip pŏhineb vesiniku leegi elektrijuhtivuse muutumisel elektriväljas kui orgaanilised ained läbi selle leegi kantakse. Orgaanilised ained lagundatakse ja ioniseeritakse leegis vastavalt mehhanismile: • CH + O  CHO+ + e • Ioonide voog registreeritakse pingelanguna vastuvŏtval elektroodil. • Kuna antud detektor reageerib süsinikuaatomite arvule ajaühikus, siis on signaal proportsionaalne määratava aine massiga. Seega mŏjutab liikuva faasi voolukiirus siin detektori signaali vähe. Leekionisatsioondetektorite detekteerimispiir on väga madal ning lineaarne mŏŏtmispiirkond on siin lai. Puuduseks on aga asjaolu, et määratavad ained lagundatakse detektorist läbiminekul ning sobimatus teatud aineklasside puhul.

26. STATSIONAARSE FAASI TÜÜBID GAASIKROMATOGRAAFIASÜldine nõue – peavad olema termiliselt stabiilsed

27. Statsionaarne faas II • * H-sideme teke, polarisatsioonil, dipool-dipoolmomendil ning molekulidevahelistel mõjudel põhinevad interaktsioonid • Liikumatute faaside polaarsusi hinnatakse Rohrschneider/McReinolds’i indeksiga,  • =x’+y’+z’+u’+s’ • x’,y’,z’,u’ ning s’ on IR väärtused peamiste analüüsitavate aineklasside tüüpiliste esindajate jaoks.

28. Aineklasside esindajad

29. TSOONIDE LAIENEMIST PÕHJUSTAVAD TEGURID GAASIKROMATOGRAAFIAS

30. TSOONIDE LAIENEMIST PÕHJUSTAVAD TEGURID II • Mida kõrgem on katsetemperatuur, seda kitsamad on reeglina piigid – analüüsid on lühemad ja difusiooni mõju on väiksem. Samuti on analüüsitavate ainete aurustumine kiirem. • Teiselt poolt – mida kõrgem on temperatuur, seda väiksemad on mahtuvusfaktorid. Temperatuuri mõju jaotuskonstandile on kirjeldatav sõltuvusega logK  1/T - seega, jaotuskonstant (ja ka mahtuvusfaktor) väheneb märgatavalt kolonni temperatuuri kasvades. • Kandegaasi voolukiiruse mõju ainetsoonide laiusele ei ole ühemõtteline. • Ühelt poolt on difusioonist tingitud laienemine seda väiksem, mida suurem on voolukiirus. • Teiselt poolt võimendub voolukiiruse kasvades massivahetusest tingitud tsoonide laienemise faktor. • Kui voolukiirus on väga väike, siis domineerib difusioonist tingitud laienemine, kui voolukiirus on väga suur, siis massivahetusest tingitud laienemine.

31. GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS • Ainete identifitseerimine e. kvalitatiivne analüüs • Standardi lisamine • Töömahukas • Puhtad standardid võivad puududa • Retentsiooniindeksi arvutamine • Homoloogilise rea liikmete mahtuvusfaktorid k’ sõltuvad lineaarselt C aatomite arvust. • Iga analüüsitava aine jaoks eksisteerib 2 normaalalkaani, millede vahel see aine kromatogrammil elueerub. • Normaalalkaani retentsiooniindeksiks on tema 100-kordne C aatomite arv

32. GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS II

33. GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS III • Kümnete tuhandete ainete retentsiooniajad on tänapäevaks määratud. Kui on tegu tundmatu ainega, siis tuleb kasutada võrdlusaineid. • Usaldusväärsuse suurendamiseks peaks retentsiooniindeksi määrama 2 erineva kolonniga (erinevate polaarsustega). • Mida polaarsem on määratav aine seda suurem on polaarse ja mittepolaarse kolonniga määratud retentsiooniindeksite erinevus (IR = IRpolar – IRunpolar). Mittepolaarsel ühendil (n-alkaan) on IR =0.

34. Mass-spektromeetri kasutamine detektorina • Gaasikromatograafist väljuvat voogu skaneeritakse mass-spektromeetri abil väga lühikeste intervallide tagant. • Analüüsi lõppedes on olemas igale ainele vastavad massispektrid, mida võrreldakse kataloogis olevate spektritega. • Puuduseks on kataloogide ebatäielikkus ja eelkõige mass-spektromeetrite kõrge hind.

35. Kvantitatiivne analüüs • Detektori reaktsioon peab sõltuma lineaarselt ainekogusest, mis täidab antud hetkel detektorit (lineaarne mõõtmispiirkond). • Detektori ruumala peaks olema palju väiksem kui kromatograafilise tsooni ruumala. • Detektor reageerib erinevatele ainetele erinevalt. • Absoluutsete koguste leidmiseks kasutatakse sise ja välisstandardi meetodeid. • Välisstandard – kalibratsioon standardlahustega • Sisestandard – huvipakkuv aine ise (standardi lisamise meetodi puhul)

36. Huvipakkuva aine kontsentratsioon leitakse järgmiselt: X=[(Y*A*C)/(B-(D*A)] • Y – lisatud sisestandardi kontsentratsioon; • A – huvipakkuvale ainele vastav detektori signaaliga seotud parameeter (N: piigi pindala); • B – seesama parameeter pärast sisestandardi lisamist; • C – standardi ruumala ja proovi koguruumala suhe ja • D– proovi ruumala ja koguruumala suhe. • Kui sisestandardi ruumala on palju väiksem kui proovi ruumala võime kasutada lihtsustatud valemit: X=(Y*A*C’)/(B-A) • C’ – standardi ja proovi ruumalade suhe.