Sissejuhatus Kromatograafiasse

1. Sissejuhatus Kromatograafiasse Sügis 2012

2. KROMATOGRAAFIA • kromatograafia on meetod, mille abil saab segusid üksikuteks komponentideks lahutada • kromatograafia teostatakse kolonnis, mis on täidetud statsionaarse (liikumatu) faasiga • läbi kolonni voolab mobiilne (liikuv) faas. • proovi sisestamisel kolonni jaotuvad proovi komponendid mobiilse ja statsionaarse faasi vahel • ainete üksteisest lahutumine pŏhineb erinevate analüütide erineval jaotumisel statsionaarse ja mobiilse faasi vahel • kromatograafia avastas 1903 a. Tsvett (vene/itaalia päritoluga keemik, töötas Varssavis, Tartus ja Voronezis. Kaasaegse variandi leiutasid Martin ja Snyge (Nobeli preemia 1953 a.) • kasutamine: 30% kôigist analüüsidest tehakse kromatograafia abil • Kromatograafilised meetodid: • gaasikromatograafia (gaas/vedelik, gaas/adsorbtsioon) • vedelikkromatograafia (vedelik/vedelik, vedelik/adsorbtsioon, ioonvahetus, eksklusioon, affiinsus, ŏhukese kihi kromatograafia)

3. Kromatogrammi saamine • Proov lahustatakse mobiilses faasis. • Proov viiakse kolonni ühte otsa. • Mobiilne faas kannab proovitsooni läbi kolonni. • Osakesed jaotuvad palju kordi mobiilse ja statsionaarse faasi vahel. • Need proovi komponendid, mis interakteeruvad statsionaarse faasiga tugevamini väljuvad kolonnist hiljem kui need osakesed, mis interakteeruvad nŏrgemini. • Ideaaljuhul on pärast teatud aja möödumist kŏik proovi komponendid üksteisest lahutunud ja jŏuavad erinevatel ajamomentidel kolonni teise otsa, kus nad detekteeritakse. • Saadud detektorisignaali (analüüsiaja vŏi mobiilse faasi ruumala funktsioonina) nimetatakse kromatogrammiks.

4. Piigi kuju funktsioon

5. Kaks efekti: • erinevad ained lahutuvad üksteisest kromatograafilise analüüsi käigus, • ainetsoonid laienevad. • Piikide laienemine vŏib hävitada lahutuvuse. • Lahutuvuse parandamiseks tuleks: • muuta selektiivselt migratsiooniaegu • suruda ainetsoonide laienemist maha

6. Põhimõisteid • Kromatograafilise lahutamise pôhiidee: mitmekordne sorbtsioon/desorbtsioon • Mobiilne faas e. eluent • Statsionaarne faas e. kolonni täidismaterjal • Aine retensiooniruumala; mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik poole aine koguse elueerimiseks kolonnist

7. Tähiste selgitused VR - retentsiooniruumala Vm - mobiilse (liikuva) faasi ruumala VS - statsionaarse (liikumatu) faasi ruumala K - jaotuskonstant (näitab kuidas aine jaguneb mobiilse ja statsionaarse faasi vahel) k' - mahtuvusfaktor (näitab aine kontsentratsiooni erinevust mobiilses ja statsionaarses faasis)  - mobiilse ja statsionaarse faasi ruumalade suhe CS - aine kontsentratsioon statsionaarses faasis Cm - aine kontsentratsioon mobiilses faasis F, u - liikuva faasi kiirus tR - aine retentsiooniaeg (aeg, mille jooksul elueerub pool ainest) tm - "surnud aeg" (aeg, mille jooksul elueeruvad ained, mis ei sorbeeru tahkesse faasi) N -efektiivsus e. teoreetiliste taldrikute arv  - kromatograafilise tsooni laienemist näitav tegur H - teoreetilise taldriku kõrgus R - lahutuvus  - selektiivsus

8. Kromatograafia pôhivalemid Retentsiooniaeg tR tR=tm(1+k')

9. Efektiivsus ja selektiivsus

10. Van Deemteri võrrand:

11. van Deemteri võrrandi üldkuju • H=A+B/u+(Cm+Cs)u • A - aine molekulide teepikkuste erinevus • (kapillaarkolonnide korral paraboolne vooluproofil) • B - ainetsooni difusiooniline laienemine kolonnis • Cm - massivahetus liikuvas faasis • Cs - massivahetus liikumatu ja liikuva faasi vahel

12. Vedelikkromatograafia (HPLC) • HPLC mobiilne faas on vedelik • gaasikromatograafia piirid: MW=400, (20% ainetest); • vedelikkromatograafia objektid: makromolekulid, ioonsed ühendid, labiilsed looduslikud ühendid • Kromatograafilisi lahutamisprotsessi eesmärk vŏib olla: • kvalitatiivne analüüs (ret. aegade vŏrdlus, standardi lisamine) • kvantitatiivne analüüs (kalibratsioon) • preparatiivne lahutamine (järgneb analüüs teise meetodiga, puhta aine saamine) • Mobiilset faasi vedelikkromatograafias kutsutakse sageli ka eluendiks.

13. Optimiseerimine • Vedelikromatograafiliste analüüside optimiseerimine taandub sageli ŏige mobiilse faasi leidmisele. • Mobiilse faasi puhul on olulisteks parameetriteks: • viskoosus (väiksema viskoossusega solvendid pŏhjustavad kolonnis väiksemaid rŏhkusid) • keemistemperatuur (madala keemistemperatuuriga solventidest on kergem vabaneda) • sobivus detektoriga (madal UV-neelduvus UV detektori puhul, etc.) • mürgisus

14. Eelistatud solvendid:

15. Eluendid • Vedelikkromatograafias kasutatavad eluendid on sageli 2 vŏi enama solvendi segu. Eluendi koostis mŏjutab nii analüütide retentsiooniaegu kui selektiivsuskoefitsienti. • Mida suurem on tugevama solvendi kontsentratsioon eluendis, seda kiiremini väljub aine kolonnist. • Selektiivsust saab samuti mŏjutada muutes eluendi koostist. • Selektiivsuste erinevuste eest vastutavad: vesiniksidemete teke, molekulidevahelised interaktsioonid. • Kui 2 piigi vaheline selektiivsus on 1 vŏi sellele lähedane suurus, siis on neid piike vŏimatu vŏi raske teineteisest lahutada. • Gradientelueerimine: eluendi koostise muutmine analüüsi käigus.

16. Kolonnide tüübid

17. Statsionaarne faas I • Kolonni täidise (statsionaarse faasi) tähtsamad näitajad: • Osakeste suurus: 3-20 micronit. Mida väiksem on statsionaarse faasi osake, seda suurem on efektiivsus, rŏhk kolonnis, lahutuvus. Suurused ei tohiks keskmisest üle 25% erineda. • Osakeste kuju: sfääriline vŏi ebakorrapärane. Efektiivsus ei sŏltu osakeste kujust, aga rŏhk kolonnis sŏltub.

18. Statsionaarne faas II • Poorsus: osakesed on kas läbinisti poorsed vŏi kaetud poorse kihiga (pellikulaarsed). Pooride d=60-500 Ǻ. • Läbinisti poorsete osakeste juhul on kolonnide mahtuvus suurem, pellikulaarsete osakeste korral on efektiivsused kŏrgemad ja kolonnide läbitavused paremad. • Pind: kolonni retentsiooni ja selektiivsuse määravad liikumatu faasi funktsionaalrühmad. Proovi molekulid interakteeruvad funktsionaalrühmadega vesiniksideme tekkimise, dipool-dipool ja elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu. • Kolonnide täidis vŏib olla looduslik (silikageel) vŏi modifitseeritud. • Vedelikromatograafia jagatakse kolonni täidiste järgi eriliikidesse. Erinevatel vedelikkromatograafia kolonnidel on erinev lahutusmehhanism ja rakendusalad.

19. Sobiva kromatograafia alaliigi (statsionaarse faasi) valik sŏltub konkreetsest proovist MW<2000 Neutraalsed molekulid • Nŏrga polaarsusega molekulide puhul kasutatakse pööratud faasi kromatograafiat, liikuvaks faasiks on vesilahused • Keskmise vŏi tugeva polaarsusega molekulide puhul kasutatakse normaalfaasi kromatograafiat, liikuvaks faasiks on orgaanilised lahustid (n. heksaan) Ioonid • Anioonide puhul kasutatakse anioonvahetuse kromatograafiat vŏi ioon-paar kromatograafiat. Eluendiks on puhverlahused. • Katioonide puhul kasutatakse katioonvahetuse kromatograafiat vŏi ioon-paar kromatograafiat. Eluendiks on puhverlahused. MW>2000 Kasutatakse geelfiltratsiooni, ja afiinsuskromatograafiat. • Vees lahustuvate ainete puhul on eluendiks vesilahused. • Vees mittelahustuvate ainete puhul orgaanilised lahustid.

20. Vedelikkromatograafi ehitus I • Eluendi pumbad: kolb-, süstal-, konstantse gaasirôhu pumbad; • rŏhud kuni 8000 psi • voolukiirused 0.2-10 ml/min • Dosaatorid • Kolonnid: standard-, väikese diameetriga-, eelkolonnid • Eelkolonnid on lühikesed (1-3 cm) ja odavad kolonnid, mis on täidetud sama statsionaarse faasiga kui vastav analüütiline lahutuskolonn. • Eelkolonnide mŏte on kinni püüda ained, mis pöördumatult adsorbeeruvad antud statsionaarsesse faasi.

21. Vedelikkromatograafi ehitus II • Detektorid: UV-VIS fotomeetrid (fikseeritav, varieeritav, skaneeritav lainepikkus), fluorestsents, elektrokeemiline, refrakomeetriline, juhtivus, mass-spektromeetriline • Detektori ülesandeks on produtseerida elektriline signaal, mis oleks proportsionaalne proovi kontsentratsiooniga. • Detekteerimispiiriks loetakse kontsentratsiooni, mis annab mürast 3 korda suurema signaali. • Liiga suurtel kontsentratsioonidel muutub sŏltuvus kontsentratsiooni ja detektori signaali vahel mittelineaarseks. • Detektori lineaarne ulatus. • Detektori raku ehitus peaks minimiseerima mullide tekkimise vŏimalikkuse.

22. Proovi ettevalmistus • Tahked ained tuleb sobivas solvendis lahustada. Parim solvent on eluent ise. • Kontsentreeritud proovid tuleb eelnevalt lahjendada. • Mŏnikord on proove vaja eelnevalt puhastada vŏi modifitseerida.

23. Kolonni valik • kas proov lahustub eluendis, mis sobib antud statsionaarse faasiga, • kas analüüdid on ioonsed vŏi neutraalsed ühendid • milline on molekulmasside erinevus lahutatavate analüütide vahel • Kolonni valik sŏltub proovi struktuurist. Vees lahustuvaid aineid peaks analüüsima pööratud faasi kromatograafia abil. Ioonide jaoks sobib ioonvahetus- vŏi ioonpaarkromatograafia. Kui proovis sisaldub isomeere vŏi kui aine ei lahustu vees peaks esimene valik olema normaalfaasikromatograafia, jne.

24. Detektori valik. • Enamus aineid absorbeerib UV kiirgust lainepikkuste vahemikus 190-220 nm. Paljud ained ka kŏrgematel lainepikkustel. Seetŏttu on esimene valik enamasti UV-detektor. Tuleb valida kŏigi huvipakkuvate komponentide jaoks optimaalne lainepikkus. • Kui proovi komponendid fluorestseeruvad ja on vaja määrata väga väikeseid kontsentratsioone tuleks kasutada fluorestsentdetektorit. • Refraktsiooniindeksi detektorit kasutatakse kui ükski teine detektori tüüp ei sobi.

25. Eluendi valik. • Eluent peaks vŏimaldama saada mŏistlikud retentsiooniajad kŏigi huvipakkuvate analüütide jaoks (k’=1-20). • Kui ükski eluent seda ei vŏimalda, siis tuleb kasutada gradientelueerimist.

26. Analüüsi optimiseerimine. • Kui lahutuvus (R) on enam kui piisav kŏigi huvipakkuvate proovi komponentide jaoks, siis on otstarbekas analüüsiaega vähendada kasutades lühemat kolonni vŏi suuremat voolukiirust. • Kui lahutus mingite huvipakkuvate komponentide jaoks on ebapiisav tuleks tŏsta efektiivsust (N), vähendades voolukiirust, suurendades kolonni pikkust vŏi kasutades peeneteralisemat täidist. • Kui lahutuvuse puudulikkus on tingitud liiga väikesest selektiivsusest, tuleb muuta eluendi koostist vŏi statsionaarset faasi.

27. Vedelikkromatograafia erimeetodid • suurt osa lahutamises omab analüüdi vastasmôju mobiilse faasiga • lahutamise mehhanismid: vedelik/adsorbtsioon, vedelik/vedelik, ioon-paar, ioonvahetus, eksklusioon, afiinsus • täidiste tüübid: mittepoorsed klaasist kuulikesed, kaetud poorse kihiga; poorsed osakesed; makropoorsed polümeerid

28. Normaalfaasi kromatograafia • Lahutamispõhimõte: mittepolaarne eluent/ polaarne statsionaarne faas • Kolonni täidis: kolonni täidisosakeste (reeglina silikageel) külge on keemiliselt seotud polaarsed funktsionaalrühmad (näiteks tsüaanorühmad). • Liikuv faas: orgaaniline lahusti (metanool, atseetonitriil). • Elueerumise järjekord polaarsuse kasvu järgi

29. Pööratud faasi kromatograafia (reversed phase) • Polaarne mobiilne faas (vesi+modifikaator) ja mittepolaarne statsionaarne faas (C2 - C18) • Mehhanism: polaarsed molekulid lahustuvad paremini eluendis, kui statsionaarses faasis ja elueeruvad varem, kui mittepolaarsed molekulid, mis lahustuvad paremini statsionaarses faasis. • Elueerimise järjekord on "pööratud" vôrreldes normaalse faasiga. • Orgaaniliste modifikaatorite (metanool, atsetonitriil, tetrahüdrofuraan) lisamine muudab eluenti tugevamaks • Rakendatakse alifaatsete vôi aromaatsete rühmadega molekulide lahutamisel

30. Ioonvahetuskromatograafia • kolonni täidisele on kantud laenguga rühmad, mis on neutraliseeritud vastasioonidega • anioonvahetajad - kvaternaarsed amiinid • katioonvahetajad - sulfonaatrühmad • môlemad rühmad dissotseeruvad täielikult ja sôltuvus pH-st puudub

31. Ioonkromatograafia: • anorgaaniliste ioonide analüüs • Kasutusel on spetsiaalne täidis: polümeerne alus (divinüülstüreen, diameeter 10 m), mis on sulfoneeritud vôi amineeritud. Elektrostaatiliselt seotakse sellega amineeritud vôi sulfoneeritud polümeeri kile (100-300 nm kiht). • supressorkolonn vähendab eluendi juhtivust: • anioonkromatograafias - katioonvahetus kolonn (H+-vormis) vahetab eluendi (nôrga happe soolad) katioonid H+ ioonidega ja tekkinud nôrka hapet juhtivusdetektor ei detekteeri • katioonkromatograafias - anioonvahetuskolonn (OH- - vormis) vahetab eluendi (HCl) aniooni OH- rühmadega ja vett ei detekteerita • eluendid: • anioonkromatogaafias: salitsülaat, boraat, bikarbonaat • katioonkromatograafias: HCl • detektorid: juhtivusdetektor, UV detektor

32. Ioonkromatograafia rakendused • laialt kasutatav anioonide määramiseks vee analüüsil, (näit. elektrijaamades)

33. Ioon-paarkromatograafia • Alternatiiv ioonkromatograafiale. Sageli efektiivsem. • Viiakse läbi pööratud faasi kolonnis, eluendile lisatakse hüdrofoobset vastasiooni. (N. sulfoonhappeid saab pööratud faasi kolonnis lahutada kui eluendile on lisatud tetrabutüülammoonium soola) • Ioonpaari lahutusmehhanism: hüdrofoobsed vastasioonid adsorbeeruvad liikumatusse faasi ning moodustavad ekvivalendi ioonvahetuskolonnile. • Eluentideks on enamasti vesilahustest puhvrid, mis vŏivad sisaldada orgaanilist solventi. • Puhvri pH ja orgaanilise aine sisaldus mŏjutavad osakeste elueerumist. • Eluendi tugevus kasvab orgaanilise solvendi kontsentratsiooni kasvuga. • Analüütide retentsiooniajad pikenevad vastasiooni kontsentratsiooni kasvamisega.

34. Eksklusioonkromatograafia (exclusion chromatography, gel permeation chromatography) • kasutatakse makromolekulide molekulaarkaalu jaotuse analüüsil • kolonni täidised on poorsed materjalid: silikageel, poorne klaas, stüreendivinüül polümeer, • kolonni täidise poorsus varieerub suurtes piirides (4 m – 250 m) • väga suured molekulid ei sisene pooridesse – elueeruvad kiiresti • väikesed molekulid jäävad kinni paljudesse pooridesse ja elueeruvad aeglaselt • vahepealse suurusega molekulid sisenevad osadesse pooridesse ja osadesse nad ei mahu ning nende retentsiooniaeg on suurte ja väikeste molekulide vahepealne • analüüsitavate molekulide molekulkaal 4m pooridel 1000 – 8000 • 250 m pooridel 200 000 – 1 500 000 • eluent: pH < 9, peab lahustama analüüsitavaid aineid • detektor: HPLC detektorid

35. Afiinsuskromatograafia: • Tahke kandjaga on seotud kovalentselt afiinsusligand (biokeemiline ühend), mis selektiivselt seob teatud proovi komponendid. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. • Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks. • Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos, polüakrüüamiid • ligandid: ensüümid, antikehad • seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil