A Genética Molecular em Análises Clínicas

1. A Genética Molecular em Análises Clínicas Prof.Doutor José Cabeda

2. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

3. Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente) Espectrofotometria

4. Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente) Espectrofotometria

5. Espectofotometria

6. Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente) A(contaminantes) Espectrofotometria

7. Quantificação de DNA • max=260 nm • max(proteínas) =280 nm • ref =320 nm • Concentração = f(OD260). Se L=1cm: • dsDNA 1OD=50µg/ml • ssDNA 1OD=40µg/ml • ssRNA 1OD=40µg/ml • Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência) • .

8. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

9. Fazer um gel de agarose

10. Electroforese

12. ELECTROFORESE • V=IR • P=I2R • A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução

13. Agarose (TAE e TBE) Seakam Nusieve Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturante Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturante Horizontais Verticais TIPOS DE GEIS

14. Electroforese em campo pulsado (PFGE)

15. Electroforese Capilar • Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) • Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência • Separações muito boas, num período de tempo inferior.

16. Electroforese Capilar (II) • Fluxo Electro-osmótico (FEO): • A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. • Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO • Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO • Moléculas negativas são mais lentas que o FEO • todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.

17. Electroforese capilar (III)

18. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

19. REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS • Brometo de etidio e análogos • Radioactividade • 32P e 33P • 35S • 125I • 14C • 3H • Tempos de exposição • Cassetes com e sem ecran repetidor • Necessidade de secagem dos geis • Nitrato de prata

20. Marcação de sondas • Radio-isótopos • 32P • 33P • 35S • 3H • 14C • 125I

21. Marcação de sondas • Digoxigenina • Biotina • detecção directa da cadeia dupla

22. Enzimas para a marcação de sondas • Polimerases • Actividade exonucleolitica • Temp. optima • estabilidade térmica • TdT

23. Tipos de sondas • Oligonucleótidos • inserts de plasmideos • prod. de PCR

24. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

25. Fotografia

26. FOTOGRAFIA • Abertura do diafragma • Tempo de exposição • Focagem e profundidade de foco • Filtros necessários • Tipos de fotos Polaroid • Sistemas alternativos

27. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

29. Aquisição computorizada de imagens de geis

30. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

32. Integração de histogramas

33. Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos • Espectrofotometria • Electroforese • Revelação dos ácidos nucleicos • Fotografia • Sistemas computadorizados de aquisição de imagem • Quantificação de bandas em geis • Reacções de restrição • Sistemas R/M • Montar uma reacção de restrição

34. Reacção de restrição

35. SISTEMAS R-M • Protecção contra DNA estranho • TIPO I: pouco frequentes (1%) • TIPO II: (93% das enzimas) • reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias • As endonucleases requerem Mg2+ e as metiltransferases requerem s-adenosylmetionina • endonucleases compostas por um homodimero • metiltransferases compostas por monomero

36. SISTEMAS R-M • TIPO IIs: • como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas • local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida • Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) • TIPO III: pouco frequentes (<1%) • TIPO IV: as restantes

37. MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO • Instabilidade térmica • Concentração de glicerol • Tampão de reacção • Actividade enzimática: • 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora • conformação e pureza do DNA • utilizar 2-3 x mais enzima • volume total > 50µl • Homogeneizar por pipetagem • Verificar a temperatura de reacção

38. Genética Molecular em Medicina Transfusional Técnicas de estudo de mutações desconhecidas Prof.Doutor José Cabeda

39. Técnicas de estudo de mutações desconhecidas • Métodos Baseados No Tm • Melting Profiles and GC clamps • DGGE • Perpendicular • Paralelo • CDGE • TTGE • Métodos Baseados na conformação • SSCP • HA • CSGE

40. Vários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total “Melting Profiles”

41. Gradiente de desnaturação Químico Temperatura O gradiente pode ser: Perpendicular ao campo eléctrico Paralelo ao campo eléctrico Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

42. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) heteroduplexes homoduplexes

43. Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

44. Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)

45. Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)

46. Métodos baseados na conformação • Conformação do dsDNA • não depende da sequência • A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos • A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” • Conformação do ssDNA • depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

47. dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido Renaturação rápida Corrida em condições semi-desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) WT1 mutantes WT2

48. Heteroduplex Analysis (HA) • Heterodupletos causam • Distorção na conformação • Migração no gel mais lenta • Heterodupletos podem existir por: • Co-amplificação por PCR de heterozigotos • Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR • Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

49. Heteroduplex Analysis (HA) • Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) • Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA • A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

50. Conformation Sensitive Gel Electrophoresis • Principio: • Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. • Método: • Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) • Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros • Utilizar fragmentos com 300-800 bp