Real Time PCR

1. RealTimePCR Ｖｅｒ．2.00 Ｒ Ｑ TaqManプローブ法

2. 励起光 Taq Man プローブの構造 Taq Man プローブが単独であるとき、レポーター色素の励起光を照射するとレポーターが蛍光を発しますが、レポーター色素の蛍光波長がクエンチャー色素の励起波長に近似しているため（約５００～６００nm）レポーターの蛍光エネルギーはクエンチャーの励起エネルギーとして使用され、クエンチャーが蛍光を発します。このためTaq Man プローブが単独であるときには、レポーターの蛍光が抑制されます。 Q R

3. + + D A A D 蛍光共鳴エネルギー移動現象 FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer)とは・・・． + D 光励起 励起状態 光励起 蛍光、熱など 光励起 FRET D 基底状態 励起された蛍光団 (Donor : D+) は，そのエネルギーを蛍光や熱エネルギーとして放出しようとする． 特定の条件を満たす分子 (Acceptor : A) が存在すると，共鳴による励起エネルギーの移動 (FRET)が起こる．この時，エネルギーを失った Donor は基底状態にもどり，同時にエネルギーを受け取った Acceptor は励起状態となる． D を励起し，FRET が起こると，励起状態の A を得ることができる．例えば蛍光物質である場合，D を励起すると，（FRETが起こり）A が励起されるため，A からの蛍光を得ることが可能である．

4. ９５℃ Q R Forward Primer ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ ５´ ３´ ５´ Reverse Primer

5. 励起光 ９５℃ Forward Primer ５´ Q ７０℃ R ５´ ３´ ３´ ５´ ５´ ３´ ５´ Taq ManプローブはPrimerよりも先にハイブリダイゼーションする（６８～７０℃付近） Reverse Primer

6. 励起光 ７０℃ Q R Forward Primer ６０℃ ３´ ５´ ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ ５´ Reverse Primer Taq Manプローブの次にPrimerがハイブリダイゼーションする（５８～６０℃付近）

7. 励起光 ６０℃ Q R Forward Primer ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ ５´ Reverse Primer PrimerにDNAポリメラーゼが結合して伸長反応が進む。

8. R 励起光 ６０℃ Q Forward Primer ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ ５´ Reverse Primer DNAポリメラーゼの伸長方向にDNAがあると、５´-３´エキソヌクレアーゼ活性により分解される。

9. R 励起光 ６０℃ Q ３´ ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ ５´ ３´ TaqManプローブが分解されるとレポーターとクエンチャーが離れ、レポーター色素の蛍光が検出できる。

10. Taq Manプローブの利点 プローブが分解されることにより生じる蛍光を検出するので、目的DNAの増幅を正確に反映する。（ SYBR Greenを使用するときには気をつけなくてはいけない、Primerダイマーなどの非特異的反応は検出されない。） Taq Manプローブの欠点 Primerとアニール温度が異なるようにプローブの設計に注意しなくてはいけない（難しい）点がある。（ SYBRGreenを使用するときはPrimerを用意するだけですむ。）プローブが高価である。 参考文献 羊土社　ここまでできるＰＣＲ最新活用マニュアル、Applied Biosystems Japan資料、 タカラバイオ株式会社　http://www.takara-bio.co.jp/index.htm