TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

1. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Kelompok 1 SaidatunNi’mah (A1C208048) Nurbidayah (A1C208045) DevyDwiRahayu (A1C208070) Zubaidah (A1C208073) Sugiannor (A1C208039) Hamdan (A1C208044) RisaAulia (A1C208029) MellaMutika Sari (A1C208031) RinaOcktaviana (A1C208013) M. SidiqOktaviandi (A1C208001)

2. PengertianTeknologi DNA Rekombinan pembentukan kombinasi materi genetik yang baru Dengancara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor

3. Teknologi DNA rekombinanmempunyaiduasegimanfaat. denganmengisolasidanmempelajarimasing-masing gen akandiperolehpengetahuantentangfungsidanmekanismekontrolnya diperolehnyaproduk gen tertentudalamwaktulebihcepatdanjumlahlebihbesardaripadaproduksisecarakonvensional

4. Teknologi DNA rekombinanmelibatkanbeberapatahapantertentu, yaitu isolasi DNA genomik/kromosom yang akandiklon pemotonganmolekul DNA menjadisejumlahfragmendenganberbagaiukuran isolasi DNA vektor, penyisipanfragmen DNA kedalamvektoruntukmenghasilkanmolekul DNA rekombinan transformasiselinangmenggunakanmolekul DNA rekombinan reisolasimolekul DNA rekombinandariselinang analisis DNA rekombinana

5. Isolasi DNA • Isolasi DNA diawalidenganperusakandanataupembuangandindingsel • Langkahselanjutnyaadalahlisissel • Setelahselmengalamilisis, remukan-remukanselharusdibuang • DNA yang telahdibersihkandari protein danremukanselmasihtercampurdengan RNA sehinggaperluditambahkanRNAseuntukmembersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telahdiisolasitersebutkemudiandimurnikandenganpenambahanamoniumasetatdanalkoholataudengansentrifugasikerapatanmenggunakanCsCl.

6. Enzim Restriksi • Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid • Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa

7. Ligasi Molekul – molekul DNA Ada tiga cara, yaitu: ligasimenggunakanenzim DNA ligasedaribakteri ligasimenggunakan DNA ligasedarisel-selE. coli yang telahdiinfeksidenganbakteriofag T4 ataulazimdisebutsebagaienzim T4ligase pemberianenzimdeoksinukleotidiltransferaseuntukmenyintesisuntaitunggalhomopolimerik 3’

8. SeleksiTransformandanSeleksiRekombinan • Dikarenakan DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan • Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid • Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu:

9. (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal (2) selinangdimasukivektorreligasiatauberartiligasigagal (3) selinangdimasukivektorrekombinandengan/tanpafragmensisipanatau gen yang diinginkan

10. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe),yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni.

11. Pembuktian Gen sebagai bahan reaksi Diagnostik dan Sidik Jari Molekular Bahan reaksi diagnostik : • Bahanreaksibiokimiauntukmengujikadarlogamenzimspesifik. • Antibodiuntukmendeteksi protein yang spesifikolehilmupengetahuantentangtekniktersebutsepertiimmunofluorescence, immunoassay radio (RIA) danenzimmenghubungkanimmunosorbentujikadarlogam (ELISA).

12. PELABELAN DNAASAM NUKLEAT IN VITRO • PelabelanAsamnukleatIN VITRO. Yang merupakansatuilmupengetahuantentangteknikyang dikenalsebagainick translation • Mempergunakanmetodeacak primer. Suatucampurandenganurutanacakhexanukleotidaditambahkanke DNA. Beberapahexanukleotidaituakandihibridisasike DNA danberperan sebagaiinisiasiuntuk DNA Polimerase

13. Synthesis of labeled DNA by nick translation

14. PENGGUNAAN GEN PEMERIKSA MELAWAN PENDETEKSIAN IMUNOLOGI • Penggunaan pemeriksaan gen tidak terbatas kepada pendeteksian viroids; dengan sedikit modifikasi mereka dapat juga digunakan untuk mendeteksi bakteri. Dalam hal ini, contohnya diberlakukan bagi suatu nitrocellulose saringan sama dengan sebelumnya.

15. KerugianMenggunakan Gen Pemeriksa • penggunaan label radioaktif, walaupun bukan metoda pemberian label yangaktif,asam nukleat sedangdikembangkan dan ini diuraikan dalam bagian yang berikutnya. • keseluruhan waktu test, yang mana pada umumnya 24- 72 jam

16. Pada sisi positif , teknologi pemeriksaanmempunyai dua keuntungan dibanding metoda pendeteksian imunologi : • Metoda dapat diterapkan tanpa modifikasi sebagai contoh darah, tinja, badan atau nanah exudates yangmana terlalu kotor untuk mengijinkan zat darah menyerang kuman dengan interaksi antigen • Teknologi pemeriksaan dapat mendeteksi pathogenicas faktor penentu yangmana tidak dapat diungkapkan secara imunologi; sebagai contoh, banyak dari kasus diare dan muntah-muntah yang terjadi pada orang yang bepergian keluar negeri, yang disebut' perut pelancong', muntah-muntah disebabkan oleh tegangan Escherichia coli yang mengeluarkan suatu enterotoxin

17. PEMERIKSAAN UNTUK LABEL NON-RADIOAKTIF • Walaupun pemeriksa berlabel dengan fosfor radioaktif memudahkan untuk pekerja riset, tetapi tidak pantas untuk suatu laboratorium diagnostik jika pengendalian mutu adalah penting untuk standardisasi test. Dengan penggunaan secara radioaktif berlabel thionucleotides mengakibatkan pemeriksaan dapat diperluas. Suatu solusi alternatif dengan menggunakan biotin- berlabel nucleoside triphosphates selama nick translation

18. BLOTTING SOUTHERN • Potensi DNA yang diagnostik- DNA hybridisasi sangat dapat ditingkatkan dengan bantuan Blotting Southern. Teknik ini dinamai Ed Southern yang dikembangkan pada tahun 1975

20. DNA dicerna dengan suatu pembatasan endonuclease dan fragmen yang mana diproduksi dengan cara dipisahkan pada suatu basis ukuran oleh electrophoresis dalam suatu agarose 'gel' agar-agar. • DNA fragmen kemudian mengubah sifat ke dalam rantai tunggal oleh endapan 'gel' agar-agar dalam alkali. Sesudah itu, 'gel' agar-agar ditempatkan pada suatu kertas saringan yang menutupi sampai terbenam dalam suatu palung penyangga/bantalan. • Suatu lembar selaput nitrocellulose ditempatkan di paling atas sehingga 'gel' agar-agar dan suatu tumpukan kertas penyerap besar ( yang pada umumnya menutupinya dengan kertas handuk) tersangkut di atas sekali. Larutan disiapkan oleh penyerap yang ditutupi dengan kertas, melalui 'gel' agar-agar dan nitrocellulose dan membawa DNA ke luar dari 'gel' agar-agar ke atas selaput itu. • Sama dengan sebelumnya, DNA diperbaiki pada tempatnya dengan mengeringkan saringan dalam suatu ruang hampa. Hasil saringan adalah suatu tiruan pada DNA fragmen mempola dari agarose 'gel' agar-agar.

21. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan Meliputi empat bidang: • Bidang kesehatan • Bidang Pertanian • Bidang Hukum • Bidang Pengemangan Ilmu Pengetahuan