Kraftspektroskopie an einzelnen Titin-Molekülen

1. Kraftspektroskopie an einzelnen Titin-Molekülen

2. AFM(Atomic Force Microscop) • Erfinder Gerd Binning • Nobelpreis für das Rastertunnel Mikroskop • Funktion wie RTM nur Kraft statt Tunnelstrom als Messgröße

3. Aufbau des AFM • 3D Piezo Motor • Feder mit niedriger Federkonstanten ca.0.1-1 N/m • Scharfe Messpitze • Feedback System zur Bestimmung und Regulierung der Feder

4. Messspitze • Die Spitze im ersten AFM war ein Diamantsplitter • Auch möglich sind Si3N4 Kristalle • Die Feder kann mit integrierter Spitze gebaut werden • Für elektrische oder magnetische Kräfte kann man feine geätzte Drähte als Spitze verwenden

5. Feder • Lithographisch hergestellt • Aus Silizium, SiliziumOxid oder SiliziumNitrid • ca. 100μm lang und 1μm dick • Ferdekonstanten 0.1-1 N/m • Resonanzfrequenzen 10-100 kHz

6. Verschiedenen Typen des AFM • Raster Kraft Mikroskop • Es können verschiedene Kräfte gemessen werden und damit • Atomare Kräfte • Magnetische Felder • Elektrische Felder • Van der Vaals

7. Betriebsmoden • Contact-mode • Auflagekraft von typischerweise 10-7 bis 10-11 • Langreichweitige Kräfte • Abstand zur Probe 10-100 nm • Feder wird nahe der Resonanz in Schwingung versetzt • Der Kraft Gradient Fz/ z verändert die Resonanz Frequenz

8. Der Versuch • Einzelmolekül Kraftspektroskopie an Titin • Matthias Rief, Mathias Gautel, Filipp Österhelt, Julio M. Fernandez, Hermann E. Gaub • Ziele • Untersuchung der mechanischen Eigenschaften des Muskelprotein Titin • und damit besseres Verständnis über die Stabilität von Muskeln

9. Die Probe • Frisch aufgedampfte Gold Oberfläche • titin Lösung 10 -100 μg/ml in Phosphat gepuffertem Salin (PBS) bei pH 7,4 • Nach 10 min abgespült mit PBS

10. Aufbau und Durchführung • Die Spitze Si3N4 wird auf die Probe gepresst, und nach kurzem Warten wieder weggezogen

11. Konstante Geschwindigkeit

12. Immunoglobulin (Ig) Domänen • Sägezahn Profil • Zähne haben abstand 22-28 nm • 150-300 pN je nach Geschwindigkeit • Vermutung: • Die einzelnen Immunoglobulin Domänen entfalten sich nacheinander • Eine vollständig Entfaltete Domäne ist 31 nm lang

13. Natürliches titin und Ig4 Ig8 • Um zu beweisen, das die Ig Domänen für die schrittweise Verlängerung verantwortlich sind wurde künstliches Titin hergestellt, das nur 4 bzw. 8 Ig Domänen enthält (Ig4 Ig8) • Bei den Versuchen mit diesem Titin wurden immer nur maximal soviele Sägezähne aufgezeichnet wie Ig Domänen vorhanden waren.

14. Wormlike chain model • Beschreibt die Kraft Dehnungs Kurve • F(x)=(kT/b)[0.25(1-x/L)-2-0.25+x/L] • Fitten des Mesergebnis eines Ig8 mit 7 Peaks, mit Hilfe dieser Formel ergab: • Anfangslänge von 58 nm (fiten des 1. Peaks) • Verlängerung von 28 bis 29 nm beim fiten des nächsten Peaks

15. Reversibel • Nach vollständiger Entspannung falten sich die Ig Domänen wieder zusammen • Dieser Vorgang war sehr oft wiederholbar => reversibel

16. Andere Methoden zur Kraftspektroskopie • Mit Hilfe eines Force clamp AFM sind folgende Methoden möglich • Konstante Kraft • konstante Kraft zwischen 50 und 200 pN • Dauer zwischen 10 und 30 sec • Kraft wächst linear mit der Zeit • ca. 100 pN/s

17. Konstante Kraft

18. Konstante Kraft • Man sieht einen Stufenweisen Anstieg der Länge • Die meisten Stufen sind 22 nm • Es gibt auch Vielfache davon, mehrere Ereignisse die nicht mehr zeitlich aufgelöst werden konnten

19. Zeitlich linear ansteigende Kraft • Das entfalten spielt sich in wesentlich kürzerer Zeit ab • aber sonst keine neuen Ergebnisse

20. Abhängigkeit der Kraft von zuggeschw. • Komplexe Moleküle haben viele Konformationen • Potentialverlauf ist Abhängig von Zuggeschwindigkeit

21. Montecarlo Simulation • Simulation eines thermischen Gleichgewichts • Annahme Ig-Domäne wird duch 6 H-Brücken gehalten • H-Brücken können brechen und rekombinieren • Zugkraft verteilt sich auf die bestehenden H-Brücken • Nur möglich wenn sehr hohe Zuggeschwindigkeiten simuliert werden

22. Andere ähnliche Experimente • Kraftspektroskopie an Biomolekülen • Auch andere Domänen können sich entfalten • Immunoglobulin • Fibronectin type III • Cadherin • α-Helix (DNS) • Entfaltung lösen Nervenimpulse aus