GDL-Symposium: Hydrokolloide VII 23.-24. April 2012, Bremerhaven

1. GDL-Symposium: Hydrokolloide VII 23.-24. April 2012, Bremerhaven Reaktivität und innovative Applikationen von Chitosan im Lebensmittelbereich Klaus Lösche ttz Bremerhaven

2. Chitin und Chitosan • Chitin ist ein Poly-ß-1,4 –N-acetyl-Glucosamin (poly-GlcNac) • Biologische Funktion: Festigkeit, Schutz u.a gegen Frassfeinde • Vorkommen: Exoskellett von Insekten und Crustacea, Zellwände von Hefen und Schimmelpilzen (inkl. höhere Pilze) ; bis zu 30-60 % Anteile) • Chitin ist ein fibrilläres Material in biologischen Komposite Strukturen (Ausnahme: Diatomea), vergesellschaftet mit Proteinen (Matrix), Polyphenolen (Insekten), Mineralien (primär Ca-Carbonat / Calcit in Crustacea)… • Chitin ist in 12 Mol/l kalte HCl löslich oder in LiCl / Dimethylacetamid (analog Cellulose), Chitosan solubilisiert in schwachen Säuren… • Nachwachsender, bioabbaubarer Rohstoff: ca. 1000 Mrd. t Chitin-Synthese / Jahr (weltweit), vor Cellulose bedeutendster Rohstoffe (mengenmäßig) • Zulassung als Lebensmittelzusatzstoff in Japan : seit 1993

3. Chitosan: ß-1,4 –Polymer des Glucosamin 2-Amino-2 –Desoxy-ß-D-Glucose N-Acetyl -Glucosamin N-Acetyl-glucosamin β -1,4-Glucan

4. Chitin -Quellen Crawfish/Crabs Fungi Shrimp Composition (Based upon Dry Weight) Chitin 25-30% 30-40 15-40%  Protein 15% 35% 5-10%  CaCO3 55% 30% Glycans  Lipids 2-5% 5-10% 5-10% Astaxanthin pigment!

5. Simplified flowsheet for preparation of chitin, chitosan, theiroligomers and monomers from shellfish waste Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

6. Verfahrensschritte zur chemischen und biochemischen (enzymatischen) Herstellung von Chitosan Chemisches Verfahren Zellmaterial Enzymatisches Verfahren Deproteinierung (Natronlauge) Deproteinierung (Proteasen) Demineralisierung(Salzsäure) Demineralisierung(organische Säuren) Chitin Deacetylierung(Natronlauge) Deacetylierung(Deacetylasen) Chitosan

7. Wichtige Eigenschaften von Chitin bzw. Chitosan im Hinblick auf medizinische, pharmazeutische und kosmetische Anwendungen

8. Chitosan-Nutzung: Prozentuale Verteilung; Heras et al. 2009

9. Chemical Properties of Chitosan • Cationic polyamine with low pKa • High charge density at pH’s below 6.5 • Adheres to negatively charged surfaces • Forms gels with polyanions • Chelates transition metals • Amenable to Chemical Modification • Both amino and hydroxyl groups can be selectively modified

10. N-Carboxymethyl Chitosan (NCMC) Water soluble, Efficient metal chelator

11. HydroxypropylTrimethylammonium Chitosan Chloride (ChitoQuat) Manuzak, Macossay, Logan U. S. Patent 6,306,835 D.S. ~ 1 Water soluble from pH 1 - pH 12, Insensitive to salts High biocidal activity

12. CMChitosanQuats Monoquat E coli MIC > 128 mg/mL Diquat E coli MIC 64 mg/mL

13. Effective Antimicrobial Fiber Blends C-W. Nam, Y-H. Kim, S-W, Ko, J Appl. Polym. Sci., 74, 2258-65 (1999) 0.5 wt% ChitQuat reduced Staph activity by 90% Blends exhibit excellent laundering durability and antistatic properties

14. Chitosan: Reaktivität / Charakterisierung • >50% Deacetylierungsgrad (des Chitins) • In 1%iger Essigsäure solubilisierbar (Chitin ist unlöslich) • Viskosität: 200 – 2000 mPas • kommerzielle Chitosan-Präparate i.d.R. >85% deacetyliert • Molmassen : 100 kDa - 1000 kDa (komplexiert oft mit Säuren wie Essigsäure, Milchsäure) • Positive Ladung in saurer Lösung: • Chit-NH2 +H2O ⇌ Chit –NH3⊕ + H2O • pKa –Wert = ca. 6,3 • Chitosan solubilisiert , wenn > 50% der Aminogruppen protonisiert vorliegen • Löslichkeit stark abnehmend oberhalb von pH 6,0 -6,5 • Max. lösliche Konzentration ist abhängig vom Chitosan-Typ : i.d.R. 10-20 g / l Chitosan • Chitosan ist filmbildend , daher geeignet für Gele und Coatings

15. Chitosan: Antimikrobielle Aktivität • Abhängig von: Chitosan-Typ, Ziel-Organismus, Randbedingungen (pH-Wert etc.) • Hefen>Schimmelpilze> Gram-positive Bakterien>Gram-negative Bakterien • Sacch. cereviseae –Fermentation durch 3,6 mg / l Chitosan inhibiert • Stopp des Wachstums von Fusarium solani durch 4 mg / l Chitosan • Wirkung von Molmasse abhängig : < 10kDa Chitosan ist aktiver als natives Chitosan (degree of polymerization : min 7) • Je höher der Deacetylierungsgrad umso wirksamer antimikrobielle Effekte… • (analog dem Anstieg der Löslichkeit bzw. dem Anstieg der elektrischen Ladung) • Saure pH-Werte verstärken die antimikrobielle Wirkung ( Hürden-Effekte) • Hohe Temperatur ( z.B. +37 °C) wirksamer als niedrige (z.B. +4 °C) • Matrix-Effekte (großer Einfluss): • Chitosan bindet viele Lebensmittel-Bestandteile wie Alginate, Pektine, Proteine, anorg. Phosphate (Polyphosphate), anorg. Polyelektrolyte, kleine Elektrolyte wie NaCl, Ca-Salze, Na-Phosphate , ionische Emulgatoren (Lecithin, DAWE ), etc.

16. Global player Chitin/Chitosan Glucosamin • Advanced Biopolymers AS (Norway) • Biothera, Inc. (Formerly Biopolymer Engineering) (USA) • CarboMer, Inc. Speciality Chemicals. (USA) • Dalian Xindie Chitin Co. Ltd. (China) • Kunpoong Bio Co., Ltd. (South Korea) 200 t/a • Meron Biopolymers (India) • Navamedic ASA (Norway) Glucosamin • Primex Ehf (Iceland) • Sonat. Co (Russia) 50 t/a • Taizhou Candorly Sea Biochemical & Health Products Co., Ltd.(China) • United Chitotechnologies, Inc. (USA) größere Produktion • HaloSource, Inc (USA), Wasseraufbereitung, Geruchsbindung • V-Labs, Inc. (USA), Carbohydrates • Cognis (BASF); Germany

17. Food applications of chitin, chitosan and their derivatives in the food industry Area of application Examples Antimicrobial agent Bactericidal Fungicidal Measure of mold contamination in agricultural commodities Edible film industry Controlled moisture transfer between food and surrounding environment Controlled release of antimicrobial substances Controlled release of antioxidants Controlled release of nutrients, flavours and drugs Reduction of oxygen partial pressure Controlled rate of respiration Temperature control Controlled enzymatic browning in fruits Reverse osmosis membranes Additive Clarification and deacidifiication of fruits and beverages Natural flavour extender Texture controlling agent Emulsifying agent Food mimetic Thickening and stabilizing agent Colour stabilization Nutritional quality Dietary fibre Hypocholesterolemic effect Livestock and fish feed additive Reduction of lipid absorption Production of single cell protein Antigastritis agent Infant feed ingredient Recovery of solid materials Affinity flocculation from food processing wastes Fractionation of agar Purification of water Recovery of metal ions, pesticides, phenols and PCB's Removal of dyes Other applications Enzyme immobilization Encapsulation of nutraceuticals Chromatography Analytical reagents Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

18. Effects of Dietary Fibers on Fecal Lipid Excretion Effects of Dietary Fibers on Fecal Lipid Excretion (McCausland CW. 1995, Deuchi K. 1994)

19. Gelbildende und nicht gelbildende Hydrokolloide Abb.: Differenzierung der Hydrokolloide nach ihrem Ladungssinn

20. Hydrogele Lösungen aus Makromolekülen durch pH-, Temperatur- oder inotrop-induzierte Gelierung Inotroper Gelbildung-Mechanismus Reaktion eines Polyelektrolyten mit entsprechenden Gegenionen (Ca2+, K⊕, Cu2+ …) Beispiel: - Gelatine, Agarase, Chitosan (bevorzugt Gelbildung durch Temperatur-Erhöhung sowie Cellulosederivate wie Chitosan) - Koazervation: Polyelektrolyt – Polyelektrolyt-Komplexe (Symplexgele) Beispiel: Cellulosesulfatemit Poly(dimethyldiallyl) ammoniumchloridChitosan  Molke z. B. feste Gele (Gelatine-Substitut), Folien… Chitosan  Schellack z. B. filmbildend, Verpackungsfolien Chitosan  Gliadin z. B. filmbildend, Verpackungsfolien Chitosan  Polyphosphat z. B. gelartige Emulsionsstabilisierung (z.B. Fleisch)Chitosan  Alginatz. B. Mikroverkapselung

21. Stabilisierung von Schäumen Interaktion zwischen Chitosan und Molkeprotein Interaktion zwischen teilweise-entpolymerisiertem Chitosan und Molkeprotein Abb.: Funktion von mikrokristallinem Chitosan

22. Colloidal charge as a function of chitosan dose for emulsionswith different interfacial areas obtained with different agitation times: (□) 3-75 min; () 7-´5 min; and (+) 15 min. Quelle: Journal of Food Engineering 32 ( 1997) p. 69-81

23. Einschluss von konventionellen oder probiotischen Bakterien in Alginatmikrokapseln durch Vertropfung Druck/ Pumpe Produkt Vibrations- Düse Na-Alginat-lösung Bakterien-partikel Ca2+Fäll- Bad Quelle: de Vrese et. al. 2007

24. Einschluss von Probiotika in Multilayer- Mikrokapseln aus Fettkern und Alginathülle Hartfett Probiotika Lyophilisat Beschichtungsbäder Chitosan (+) Alginat (-) Vibrationsdüse große runde Partikel (Kälte) Fällbad Quelle: de Vrese et. al. 2007

25. Untersuchung eines mehrschichtigen Kapselaufbaus durch Messung der Oberflächenladung der Partikel Quelle: de Vrese et. al. 2007

26. “Particle Charge Detection” (PCD) (in Aqua bidest.)” 6350 Coulomb/g -0,58 Witepsol H 37 +Chitosan(0,5%Tween 80) -2828 Quelle: de Vrese et. al. 2007 de Vrese et. al. 2007

27. Schmelzen von Chitosan-Alginat- beschichteten Hartfett-Mikropartikeln Feste Partikel Erweichen geschmolzen Quelle: de Vrese et. al. 2007

28. Chitosan Vernetzungsreaktionen, Transglutaminase-Katalyse mit Protein R-Glu-CO-NH2 + H2N-Chitosan R-Glu-CO-NH-Chitosan+NH3 Beispiel: Kreuzvernetzungen Molkenproteine Milchproteine Emulsionsstabilisierung Soja-Proteine Coating von Proteinfilmen Myosin, Actin Überzüge von Proteinhaltigen Lebensmitteln Weizenkleber Anti-Allergikum Seide anderes anderes

29. Künstliche Zellen: Nano-Reaktor Glucose-1-phosphat Phosphat Phosphorylase Stärke “Wand” des Koazervattröpfchens Amylase Starch Maltose Glucose-1-phosphat Phosphat Phosphorylase

30. Permeabilitäten von Chitosan-Membranen und von Cellophan

31. Coatings Coating layer Volatile compounds aroma • Functional ingredients can be incorporated in coatings • Antioxidants • Antimicrobials • Nutraceuticals • Flavors • Colorants Fresh produce(Water, Carbohydrate, Proteins, Pigments, Aroma) GasesO2/CO2/Ethylene Moisture Figure 1: Functional properties of an edible coating on fresh fruits and vegetables

32. Examples of edible coating applications on fruits and vegetables that have been investigated

33. Examples of edible coating applications on fruits and vegetables that have been investigated

34. Biokonservierung von Getreide-Saatgut durch Chitosan Ungeschütztes Getreidekorn (Saatgut) Chitosan-Coating Schimmelschutz durch pflanzl. Chitinasen Chitosan Induktion und Expression von Chitinasen Chitinase

35. Minimal inhibitory concentrations (MIC, ppm) of chitosan and derivatives for different bacterial cultures* *Symbols are: DD69Ð69% deacetylatedchitosan; SCIÐSulphonated chitosanÐ0.63% S; SC2ÐSulphonated chitosanÐ13.03% S; SBC± Sulphobenzoylchitosan; NTÐNottested Data adaptedfrom Chen et al. [2] Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

36. Antibakterielle Aktivität von Chitosan in Abhängigkeit von pH-Wert und Chitosan-Charge (TriErnyDyahningtyas, 2010)

37. Einfluss eines Chitosan-Coating von Shrimp-Fleisch auf die Gesamtkeimzahl , S.typhimorium und E.coli u.a. bei Raumtemperatur

38. Orangensaft: Chitosan statt Pasteurisation Orange juices enriched with chitosan: Optimisation for extending the shelf-life Innovative Food Science and Emerging Technologies 10 (2009) 590–600 A. B. Martín-Diana 1, D. Rico 1, J.M. Barat 2, Catherine Barry-Ryan 1 a 2. Institute of Food Engineering for Development, Department of Food Technology, Universidad Politécnica, Camino de Vera s/n, 46022, Valencia, Spain 1. School of Food Science and Environmental Health, Dublin Institute of Technology (DIT), CathalBrugha Street, Dublin 1, Ireland

39. Chitosan : Folienherstellung , essbare Coatings für Früchte mit antimikrobieller (antifungaler) Aktivität http://www.youtube.com/watch?v=Ia4gwKYAdh4&feature=youtube_gdata_player , 20.04.2012

40. Oxidation von Phenolen durch Polyphenol-Oxidase (PPO): Enzymatische Bräunungsreaktion Links: Kontroll-Versuch Apfelscheibe Rechts : Apfel mit Chitosan-Lösung behandelt (1 % Chitosan in 1%iger Essigsäure-Lösung)

41. Enzymatische Bräunungsreaktionen EnzymatischeBräunungsreaktion: Melanosis –Verlaufbei Shrimps (Courtesy of Dr. W.S. Otwell, University of Florida, 2005).

42. Die Affinität von Chitosan zu bivalenten Metall-Ionen („Irving-Wlliams –Order“): Cu 2+ > Cd 2+ > Pb 2+ , Ni 2+ > Co 2+ (Muzarelli & Delben 1992). Die Bindungs-Kapazität ist abhängig vom pH-Wert , der Ladung, Temperatur u.a.m. Int. J. Biol. Macromol., 1987, Voi 9, April

43. Chitosan : Chelatisierung von Kupfer führt u.a. zur Gelierung Kupfer-Sulfat (1%ige wässrige Lösung) in Chitosan-Lösung vertropfen (1% Chitosan gelöst in 1% iger Essigsäure)

44. Vereinfachter Mechanismus einer Hydroxylierung und Oxidation eines Diphenols durch Phenoloxidase Phenoloxidase ist ein Kupfer-Enzym

45. Effect of chitosan coating on polyphenoloxidase activity in fresh-cut mushroom during 15 days of storage at 4°C Quelle: Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, Vol. 58, No. 1, pp. 95-105

46. Improved preservation effects of litchi fruit by combining chitosan coating with ascorbic acid treatment during postharvest storage Dequan Sun1, Guobin Liang2, Jianghui Xie1, Xintao Lei1 and Yiwei Mo1* http://www.academicjournals.org/AJB African Journal of Biotechnology Vol. 9(22), pp. 3272-3279, 31 May, 2010

47. Irradiated chitosan treatment on storage life of papaya

48. Potential Markets for Chitinous Materials • Waste Treatment: • Metal chelating cationic flocculating agent • Sewage effluents • Metal finishing/electroplating wastes • Paper mills • Radioactive wastes • Protein flocculation for feed market from: • Rendering plants, Milk and Vegetable Processing • Poultry/Egg processing • Single Cell Protein Recovery • EPA approved FDA/AAFCO approved

49. Beispiel Anwendung im Abwasserbereich • Flockungsmittel • Prozesswasserbehandlung • Konkurrenz: PolyAcrylAmid • Vorteil günstiger Preis • Nachteil WGK: 2-3 DDA <80 Viskosität <250 Asche >3%

50. Effect of chitosan on reduction of solid materials from food processing wastes Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)