Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo el ő fordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakulj

1. Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái Két fő stratégia: • Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak • ha a fehérje mérgező a gazdasejtre, akkor először inaktív fehérjét állítunk elő, majd ezt aktiváljuk, ehhez kell az in vitro “refolding” Az aktív forma esetén “csak” tisztítani kell a fehérjét

2. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK AKTÍV FORMÁBA VITELE Három fő lépés: 1. Az oldhatatlan “inclusion body”-t szolubilizáljuk, alacsony vagy magas pH, emelt hőmérséklet, detergensek, magas koncentrációjú szervetlen sók, vagy szerves oldószerek. A legelterjedtebbek: urea, vagy guanidin-hidroklorid, esetleg redukálószer (pl. DTT) jelenlétében. 2. Refolding híg fehérje oldattal - ha nincs diszulfid híd, akkor a fehérje denaturálószer lassú eltávolítása - ha diszulfid hidak vannak, akkor a renaturáció mellett a diszulfid hidakat is ki kell alakítani, szerkezet stabilizáló hatásuk van. levegőztetés, tiol-diszulfid párok hozzáadása, pH optimalizálása 3.Az aktív és inaktív forma szétválasztása pl. affinittás kromatográfia, preparatív SDS-PAGE, RP-HPLC, FPLC stb.

3. trp promoter alapú vektorok - alaposan vizsgált, jósolható eredmény - erős, 2-30% a rekombináns/összfehérje - alapállapotban alacsony expresszió, de toxikus fehérjékre ez nem elég, pBR322 vektorban kb 50x-es indukció - majdnem minden E. coli sejtvonalban használható - magas kópiaszámú plazmidok nem használhatók, nincs elég trp represszor Probléma: triptofán elvonás az indukció – egy kissé nehézkes

4. Kétkomponensű trp alapú expressziós rendszer Invitrogen ptrpcI Kromoszómán integrálva

5. T7 RNS polimeráz alapú vektorok - T7 promoter nagyon szelektív, a gazdában nincs ilyen promoter általában - T7 RNS polimeráz 5x gyorsabb, mint az E. coli-é, azaz már a transzkript is domináns Gazdasejtek: Standard klónozó vektorok klónozásra BL21 (F-, ompT-, lon-) expresszióra, lizogén sejtváltozatok: DE3 bakteriofág, immunitási régió, lacI gén, lacUV5 promoter lacZ eleje + T7 RNS polimeráz génje,integrálva kromoszómába Nagyon toxikus fehérjék esetén pLysS, pLysE T7 lizozim: természetes inhibitora a T7 RNS polimeráznak, E.coli tudja tolerálni, mert nem képes áthatolni a belső membránon pACYC184 vektorba van beépítve, catr, kompatibilis vektor pLysE nagy mennyiséget, pLysS kevesebb mennyiséget termel (ellentétes orientáció, tet promoter CE6 bakteriofág  tartalmazza a T7 RNS polimeráz génjét, így az indukció kívülről bejuttatott gén

6. kromoszóma lacUV5 int lacI lacZ T7 RNS polimeráz int 10 vagy T7/lac Prom. RBS termeltetendõ fehérje génje vektor bla ORI A pET vektorokon alapuló, indukálható fehérje termelés elvi sémája

7. A pET rendszer

8. pET vektorok • pBR322 származékok, • ampicillin, vagy kanamicin rezisztensek • 10 promoter, a T7 fág 10-es génjének (kapszid) erős promótere 1. Transzkripciós vektorok T7 promoter van, de nincs transzlációs iniciációs szignál különféle verziók, stop szignálok bevitele vagy sem, fúziós partner esetleg a C terminálison Visszaszorulóban vannak T7lac promoteres változatok Nagyon toxikus fehérjék esetén dupla biztosítás: a T7 promotertől startpont környékére a lac operátor szekvencia klónozása, elegendőlacI biztosítása, a vektorba beépítették ellentétes irányban

9. Két transzkripciós vektor példa

10. Transzlációs vektorok • 10 transzkripciós és transzlációs szignálok, • mindegyik típusú egy sorozat különböző leolvasási keretekkel • Egy rövid fúzió az első 10 aminosavval (g10),de NdeI-gyel elkerülhető.  • Esetenként  206aa fúzió  stabilitás

13. Plazmid stabilitási teszt   lemezek: ampicillin, IPTG, mindkettő és egyik sem Mik nőnek fel? 1. egyik sem: minden sejt 2. ampicillin: plazmid tartalmú sejtek, 3. IPTG: plazmid mentes sejtek, vagy expressziós mutánsok 4. IPTG, amp.: plazmid marad, de az expressziós készség elveszett

14. ptac alapú vektorok: pGEX sorozat GST: mindig N-terminális fúzióelvileg szolubilizál Nem lehet denaturáltan tisztítani

15. Arabinóz alapú expressziós vektorok Vektor felépítés Szabályozás Szekréciós vektor Kontrollálhatóság

16. Fehérje termeltetés in vitro In vitro transzláció • Előnyei: • Oxidatív környezet • Citotoxicitás elkerülése, farmakológiai alkalmazások • Nincs membrán, a termék azonnal a reaktortérbe kerül • gyors • Hátrányai: • Drága • Kitermelés korlátozott Két fő stratégia RNS polimerázzal +sejt extraktummal Tiszta komponensekből

17. Az in vitro fehérjetermeltetés folyamatábrája

18. T7 alapú rendszerek

19. Az igazán in vitro rendszer

20. ATGGAACGCCGCTATTGCCATCGCATTAGCACCATGGCGAGCGCGAACGATCATGCGCCGCCGTATAACGAATGGTATGAAGCGCGCTAA

21. MERRY CHRISTMAS AND HAPPY NEW YEAR 1 atggaacgccgctattgccatcgcattagcaccatggcgagc m e r r y c h r i s t m a s gcgaacgat a n d catgcgccgccgtataacgaatggtatgaagcgcgctaa h a p p y n e w y e a r -