基因内非编码 RNA 及剪切

1. 基因内非编码RNA及剪切 赵珊 学号：10808049

2. 一、真核生物中非编码RNA（ncRNA） 1、定义： 非编码RNA，指的是不被翻译成蛋白质的RNA。它作为关键因子参与细胞内部分调控过程。 2、功能： 涉及转录水平和转录后水平的基因表达调控。 包括介导染色质修饰、调控转录因子活性、影响mRNA的稳定性及mRNA的加工与翻译, 调控蛋白功能和定位等。在遗传印迹、染色体相关基因的剂量补偿及许多分化发育过程中都起着关键作用。

3. 3、分类： 大致分为2类：“看家RNA”与“调控RNA” 。 “看家RNA”：包括tRNA、rRNA、snRNA （小核RNA ） 、snoRNA、RNasePRNA、tmRNA、h YRNA、RNase RP和端粒 RNA等。 “ 看家RNA” 一般都属于组成型表达, 对细胞的生存以及基本功能是必需的。 “调控RNA”：可分为转录调控子、分布调控因子、转录后调控因子、蛋白功能调节因子等。 “ 调控RNA” 一般在组织发育或细胞分化的特定阶段表达, 或者是对外界环境应激表达, 调控一系列的生物过程。

4. 4、ncRNA在真核生物基因组中的存在： • A 基因间隔区中 • B 内含子中 • C 蛋白基因的开放阅读框中（单／多顺反子）

5. 二、核仁小RNA （snoRNA ）及其基因结构 1、两个主要的典型核仁小RNA（snoRNA ）： box C/D 和 box H/ACA snoRNAs 每一种snoRNA都与不同的核心蛋白结合来形成小核仁核糖核蛋白颗粒(snoRNP) ，用于功能修饰。 abox C/D snoRNA 家族 （1）结构： box C/D snoRNA 包含有两个短的序列元件， 即位于5 ‘ 末端的box C(RUGAUGA)和3’ 末 端的box D(CUGA)。多数box C/ D snoRNA 基因的5‘ 和3’ 末端都有4 － 5 nt 的反向重复 序列，可以形成较为稳定的短茎结构，这一 结构在snoRNA 的生物合成和核仁定位过程 中起关键作用。

6. （2）功能： 大部分 box C/D snoRNA 都是通过反义互补行使功能，最为常见的是指导rRNA 特定位点的2'-O- 甲基化修饰。所谓“反义互补”是指在box D 或box D' 上游的一段10 － 21nt 的片断，能够与靶RNA 形成严谨配对，从而指导特定位点的修饰。其中少数box C/D snoRNA具有两段反义序列。

7. b box H/ACA snoRNA家族 （1）结构： box H/ACA snoRNA 具有保守的 “发夹- 铰链- 发夹- 尾 (hairpin-hingehai r p in -t a i l ) ”的 二级结构。box H (ANANNA，N 代 表任一核苷酸)位于单链形式的铰链区， ACA 则一般位于3‘ 末端上游3 个核苷 酸处。 （2）功能： box H/ACA snoRNA的指导序列位于单个或者两个发夹内部的“假尿嘧啶化泡”(pseudouridylation pocket) 内，它们可以与靶RNA上的被修饰位点两翼序列各形成4 － 8nt 的互补配对。

8. 2、功能： 它们是负责引导目标RNA（大部分的普通的rRNAs 及snRNAs） 2 ’—O—甲基化和假尿苷化的。 3、存在： 根据编码snoRNA 的序列是否从属于其他基因，可将其分为独立编码的snoRNA 和内含子编码的snoRNA。 a 动物和一些酵母菌中： 大多数snoRNA是由内含子编码的，其加工大部分是依靠剪切的。 通过从5’端到3’端的对线性内含子的核酸外切来释放核仁小核糖核蛋白。 内含子编码的snoRNA基因依赖于它们宿主基因的转录——这些宿主基因大部分编码与核糖体的发生及核仁功能相关的蛋白质。

9. 动物及酵母菌的snoRNA从线性化 的内含子中通过核酸外切产生。 这个过程依赖剪切。

10. b 植物中： （1）大部分植物snoRNAs由基因的多顺反子组成，表达前体snoRNAs。 　　从前体snoRNA转录本中分离单体snoRNA的机制：在酵母菌中，这个过程由RNaseIII来完成。在酵母菌snoRNA的沉默区之间包含着茎环结构，蓬出的核苷酸被RNaseIII核酸内切作用剪切，在剪切之后，Xrn1p 和 Rat1p催化核酸外切产生了成熟的snoRNA。 （2）由内含子编码 　以单体形式存在（如同酵母菌及动物中），或者是作为内含子snoRNA簇存在（只在植物中被发现）。 植物从内含子中产生的snoRNA不依赖剪切，成熟snoRNA直接从转录本中释放。

11. 酵母菌及植物的多顺反子snoRNAs 及植物的内含子snoRNAs，先由核酸 内切作用释放（红色箭头），再进 行核酸外切作用。 整个过程不依赖于剪切。

12. 三、微RNAs(miRNAs) 及其基因结构 1、定义： miRNAs是小的ncRNAs,大约有21到23nt的长度。在动物和植物中它们通过碱基配对到目的mRNAs，在转录后水平调节基因的表达。 2、存在： a 在动物中，大多数miRNAs都是由内含子编码的。然而与动物内含子snoRNAs相反的是，动物中的内含子miRNAs能在内含子中成簇产生。 b 在植物中，直到现在，发现miRNA的大部分是作为单顺反子或多顺反子转录单位，存在很少的内含子miRNA。

13. 3、功能： miRNAs与目标mRNAs有互补性，通过清除m RNA或通过翻译抑制来调节其表达。除此之外，miRNAs也能刺激翻译。

14. 4、功能举例： 在植物中，miRNAs几乎完美的互补性，使大多数的目的m RNA被清除、降解了。植物miRNAs典型地调节了发育过程并回应压力，这反映在他们在特殊的组织以及特别的发展阶段进行表达，并且它们的表达水平在不同环境或者不同生长状况下不同，并且对植物激素的反应中表达水平不同。 压力引导的对miR-399磷酸盐水平的调节的研究： 通过碱基配对到ncRNA、IPSI，调节miR-399的活动，ncRNA、IPSI隐蔽了miRNA ,阻止了它与目的mRNA相互作用，使其不能达到清除目的m RNA的作用。这是miRNA的活动被细微调节的好例子。

15. 5、产生： miRNAs从前体miRNAs转录本中产生，这种前体折叠形成了广大的双折叠茎环结构。 a 在动物中，在核内，由RNaseIII剪切初期miRNA产生了中间产物——前体miRNA，然后在细胞质中被Dicer酶作用产生成熟的miRNA，然后被加入到由RNA介导的沉默复合体中。 b 在植物中，初期miRNA及前体miRNA的形成过程都发生在核内，由DICER-LIKE 1从前体中释放了成熟的miRNA。

16. 四、剪切及内含子snoRNAs • 由于植物和动物的内含子的二级结构能影响剪切效率及剪切的选择，因此snoRNAs及初期miRNAs 有潜力去影响剪切过程。 • 例如： 在酵母菌中，一个内含子snoRNA的位点改变降低了snoRNA及宿主m RNA的产生效率，这暗示了在形成剪切体及snoRNP装配体之间存在一个竞争。相反的，没有证据证明在脊椎动物中内含子H/ACAsnoRNP的装配和基因剪切之间存在相互作用。 • 依靠专门的蛋白质-蛋白质相互作用，剪切过程可能会影响snoRNP的装配，而snoRNA在内含子中的位置有可能影响对于宿主内含子的剪切效率。

17. 五、剪切及内含子miRNA 动物中的剪切方式： a Drosha从切断的套索中切出了前体miRNA， b 从分开的内含子中产生前体miRNA c从未剪切的前体m RNA中产生前体miRNA 因此，剪切产生mRNA及产生miRNA将会相互排斥。但是如果剪切复合体的存在，则前体mRNA的断裂不会抑制其剪切。

18. 动物及植物中的内含子miRNAs ,及动物内含子miRNA簇。 在Pre-mRNA剪切后，由Drosha 或DCL1从内含子套索或者是双分支内含子中 产生Pre-miRNA。 未剪切的m RNA，或者Pre-miRNA的产生和mRNA的产生互相排斥，而只产生 Pre-miRNA，或者形成 剪切复合体后产生Pre-miRNA和mRNA。

19. 在植物中，举例： 　在11个现在已知的植物内含子miRNAs中，miR162a和miR838与Arabidopsis DCL1.的调节是有关的。 ａ：miR162a ，存在于At5g08185中第二个内含子中，目标是降解DCL1mRNA。 miR162a和它的宿主基因： 　这个基因的转录本显示了一个选择性剪切的复杂模式，有至少六个不同的剪切变体。只有一些转录本包含有前期miRNA，并能生成成熟miRNA。其他将不会产生成熟miRNA。可变剪切位点的位置的检测清楚地证明了在剪切和miRNA产生间存在竞争，或者说在剪切位点处剪切因子的装配与前体mRNA二级结构形成之间存在竞争。

20. 例如，从真正的5’剪切位点到前体miRNA的AG的剪切，产生了包含完整的前体miRNA mRNA的转录本（图３中ＡＳ２） • 相反的是，由前体miRNA茎环结构中隐含的5’剪切位点及一个隐含的3’剪切位点剪切内含子，剪切掉了包含miR162a序列的前体mRNA臂。因此不能形成合适的二级结构来加工生成miRNA。（图３中ＡＳ３） 图：为包含有miR162a 的 At5g08185 基因的选择性剪切。 4种不同的剪切方式产生了5种不同的转录本，其中只有未剪切的pre-mRNA, AS1 和AS2包含有pri-miRNA。

21. ｂ：miR838由来自DCL1的基因的内含子14所编码，可能通过从前体m RNA中形成miR838而自动调节了DCL1的mRNA的表达。 　检测到DCL1mRNA的片断在miR838的位置分开了，这暗示着在剪切及miRNA的产生之间存在一个直接的竞争。

22. 　总结 　　　考虑到这些剪切事件，前体m RNA的二级结构在剪切上作用已经表现出来了。 　　　在ＡＳ２中，在茎环结构碱基的5’端隐含的3’端剪切位点（ＡＧ）的使用暗示着这事件发生在前期miRNA折叠之后，抑制了对真实的3’剪切位点的选择。 　　　在ＡＳ３中使用了一个隐含的5’剪切位点，这个位点临近最终的茎环结构。这将不可能在前期miRNA折叠之后发生，因为在茎环形成阶段，与U1snRNA互补的位置是碱基配对竞争的。 　因此，剪切被miRNA的二级结构所影响，植物中内含子的二级结构影响了剪切的效率和剪切位点选择的准确度。也可能剪切事件被前期miRNA装配复合体的前期组合所影响，像snoRNA那样。

23. miRNA剪切的生物学意义 　　　剪切本身被许多作用因素所调节，这些因素根据细胞内或细胞外的刺激或信号通路选择剪切模式。宿主m RNA和ｍｉRNA的产生将会依赖于其在内含子中的位置、在转录期间及转录后这些RNA折叠的动力学、以及剪切复合体的作用。 miRNA及其剪切，尤其是选择性剪切，在动植物的发育和压力反应方面都有重要的作用。

24. 六、snoRNA及miRNA的相似性及进化关系 １、相似性： 　　动植物系统中snoRNA及miRNA的内含子组织，以及它们的加工方式在许多方面都是相似的。snoRNA包含着与r RNA 或者是snRNA的互补区；miRNA包含着与m RNA的互补区；他们的稳定性、加工和与蛋白质相连需要其二级结构。 ２、进化关系： SnoRNA的进化和miRNA的进化也是平行的；在两种ＲＮＡ中都发生复制和进化，正如在内含子及非编码区中ncRNA簇及所显示的那样。一些snoRNA及miRNA在进化上是相关的，或者是同一个基因进化而来的。有趣的是，来自一个原始植物的三个U14snoRNA的结构包含boxC/DsnoRNA的所有的特征，也具有暗示着前体miRNA的广泛的二级结构。

25. 　　　内含子序列比编码蛋白质的外显子面临较少的选择压力，它们可以允许序列缺失、序列插入、序列重复等。因此内含子有一个很大的潜力进化，形成新的编码内含子的ncRNA，它也能推动在宿主基因中内含子——外显子结构的变化。　　　内含子序列比编码蛋白质的外显子面临较少的选择压力，它们可以允许序列缺失、序列插入、序列重复等。因此内含子有一个很大的潜力进化，形成新的编码内含子的ncRNA，它也能推动在宿主基因中内含子——外显子结构的变化。 　　　由于高通量测序的快速发展及成本的降低，将会发现更多内含子ncRNAｓ。再加上比较基因组学这个有力的工具，特别是对内含子保守性的分析，将得到基因内ncRNAｓ进化和功能动力学的新的观点。