1 / 31

Proteomics: the global analysis of proteins

Proteomics: the global analysis of proteins. Ch 10. SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE gel). Western blotting. can detect the specificity protein detect one protein in a mixture of any number of proteins. Method. (1) Proteins are separated by gel electrophoresis.

tassos
Download Presentation

Proteomics: the global analysis of proteins

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Proteomics: the global analysis of proteins Ch 10

  2. SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE gel)

  3. Western blotting • can detect the specificity protein • detect oneprotein in a mixture of any number of proteins.

  4. Method (1) Proteins are separated by gel electrophoresis

  5. (2) The proteins are transferred to membrane (nitrocellulose or PVDF)

  6. Western blotimg

  7. (3)blocking (4)add primary antibody (5)add labeled secondary antibody (enzyme .Fluorophore….)

  8. Gold nanoparticels?

  9. two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

  10. Sanger’s法(Sanger’s method) 1945年 蛋白質或胜肽的胺基末端決定方法 51 residues 100g >10 years

  11. Edman切割法(Edman degradation) 可能是目前蛋白質序列分析中，最重要的技術 蛋白質胜肽定序儀(Protein peptide sequenator) 自動化分析蛋白質的序列

  12. Mass spectrometrymatrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) and time-of-flight (TOF)

  13. MALDI-TOFmatrix-assisted laser desorption inoization- time of flight MS本身有三個主要部份 第一個部份是來源（source），由樣品產生離子；第二個部份是質析（mass analyzer），依離子質量/價數【mass/charge（m/z）】的比例分開它們；第三個部份是偵測（detector），也就是mass analyzer的結果。

  14. MALDI-TOFmatrix-assisted laser desorption inoization- time of flight 將待測物peptides與matrix混合，matrix中的微小分子，會吸收特殊波長的光。source這兒提供雷射光，matrix吸收光子而激發電子，釋放的能量轉到sample中的peptide上，離開matrix表面進入空氣中。這樣的離子化過程，依樣品的性質，產生正離子或負離子，正離子的產生是在脫離matrix的過程中，接受了質子所致。每一個peptide分子會接受單一的質子，因此，大部份的peptide離子都會帶一個正電。在MALDI形成這樣的離子後，再送入TOF mass analyzer分析。

  15. MALDI-TOFmatrix-assisted laser desorption inoization- time of flight TOF（time of flight），能測得離子由analyzer一端到另一端（detector）的時間，m/z值愈大，時間愈短。MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異，但是這種測量直線行進速度的TOF解析力不夠高，造成直線型TOF低解析力的原因，在於相同m/z值的離子，直線行進速度也有快慢之別。

  16. MALDI-TOF MS 優點 第一，操作簡便，是所有MS中最容易學會的一種，可以在一天之內分析上百件樣品。 第二，需要大量製備蛋白質樣品的地方，目前從2D 電泳膠體的製作、蛋白質點（protein spots）的取出及酵素水解，都採用自動化的設備，MALDI-TOP也能以這樣的形式存在，減少人力、提高效率。 第三，隨著TOF分析方式的改良，得到的蛋白質體數據也愈正確。 第四，MALDI-TOF MS的靈敏度高，可以偵測到少量的（可到10-18 mole）蛋白質。

  17. MALDI-TOF MS 缺點 第一，MALDI-TOF MS可以提供正確的「質量（mass）」資訊，卻不能獲得詳細的「序列（sequence data）」結果。 第二，分析的成敗，幾乎取決於樣品製備的品質，如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染，或是界面活性劑（detergen）沒有去除乾淨，都會使樣品在MALDI source的電離（ionization）受到極大的影響。MALDI-TOF MS對此特別敏感。

  18. 檢測流程 • LCM (Laser Capture Microdissection)

More Related