乳酸菌和苹果酸 - 乳酸发酵 Malolactic bacteria and Malolactic fermentation

1. 乳酸菌和苹果酸-乳酸发酵Malolactic bacteria and Malolactic fermentation 刘树文

2. 葡萄酒是一种生物转化制品，所涉及的微生物包括：葡萄酒是一种生物转化制品，所涉及的微生物包括： • 酵母菌 • 乳酸菌 • 其他杂菌

3. 苹果酸-乳酸发酵定义Malolactic fermentation (MLF) MLF的定义 苹果酸-乳酸发酵（Malo-lactic Fermentation，,MLF)是在乳酸细菌的作用下将苹果酸分解成乳酸和二氧化碳的过程。

4. 一、乳酸菌 乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的统称。该类细菌 无芽孢、革兰氏染色阳性。 不是微生物分类学上的名称。 群体庞杂，目前至少可分为18个属，共有200多种。

5. 1857年Pasteur最先描述了乳酸菌的特征，并用实验证明这类细菌可使无菌的乳汁变酸。 • 1914年，瑞士的葡萄酒微生物学家Hermann Müller-Thurgau和Osterwalder才将葡萄酒中乳酸菌引起的酸度降低现象，即苹果酸向的乳酸转变过程定名为苹果酸-乳酸发酵（malolactic fementation，MLF）。

6. 与葡萄酒相关的乳酸菌

7. 乳杆菌属 细胞形态多样，从长的和细长状到 弯曲型及杆状，也常有棒形球杆状， 一般形成链。 生长温度2-53℃，最适温度30-40℃。 耐酸，最适pH通常为5.5-6.2 DNA中G+C含量摩尔分数为32%-53% 德氏乳杆菌 [Lactobacillus delbrueckii (Leichmann) Beijerinck 1901]

8. 片球菌属 细胞圆球型，在垂直的两个平面交替 分裂形成四联状，但不普遍，一般细 胞成对生，单生者罕见，不成链状排列 DNA的G+C含量摩尔分数为34%-42%。 戊糖片球菌 Pediococcus pentosaceus

9. 表6-3 与葡萄酒酿造相关的片球菌属（Pediococcus）中种的特征 表中符号：+，90%以上的菌株阳性；－，90%以上的菌株阴性；d，11%-89%的菌株阳性；ND，未测定

10. 明串珠菌属 细胞球型，但通常呈豆状，尤其 当生长在琼脂固体培养基上时。 常成对和链形排列 可在5-30℃生长，最适温度20-30℃。 所有的种都需要烟酸+硫胺素+生物素， 而不需泛酸或泛酸的衍生物。 肠膜明串珠菌 [Leuconostoc mesenteroides] DNA中G+C含量摩尔分数为32%-53%

11. 酒球菌属 嗜酸。生长于pH3.5-3.8葡萄汁和果酒中， 在起始pH4.8的条件下生长更好。 10%（v/v）乙醇不抑制其生长。 最适生长温度22℃。 DNA中G+C含量摩尔分数为32%-53% 酒酒球菌 Oenococcusoeni

12. 现代葡萄酒酿造原理 • 要获得优质红葡萄酒，首先应该使糖被酵母菌发酵，苹果酸被乳酸细菌发酵，但不能让乳酸菌分解糖和其它葡萄酒成分； • 其次，尽快地使糖和苹果酸消失，以缩短酵母菌或乳酸细菌繁殖或这两者同时繁殖的时期； • 第三，当葡萄酒中不再含有糖和苹果酸时（而且仅仅在这个时候），葡萄酒才算真正生成，应该尽快地除去微生物。

13. 二、苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒质量的影响 • 降酸作用 • 增加细菌学稳定性 • 风味修饰 • 颜色发生变化

14. 发酵酒石酸 泛浑病（酒体瘦弱，色调变淡） 发酵甘油 苦味病（酒变苦） 产生多糖 葡萄酒黏稠病 三、乳酸细菌可能引起的病害 发酵糖 乳酸性酸败（酸白菜等气味、乳酸杆菌引起）

17. 四、苹果酸-乳酸发酵的机理 • 苹果酸—乳酸发酵是在葡萄酒酒精发酵结束后，在乳酸菌的作用下，将苹果酸分解为乳酸和CO2的过程，但更确切地讲，应该是将L－苹果酸分解成L－乳酸和CO2的过程。 • 研究证实苹果酸—乳酸发酵是在苹果酸－乳酸酶直接转化L－乳酸和CO2。

18. 苹果酸-乳酸发酵的机理

19. 苹果酸-乳酸发酵的机理 • 途径1：苹果酸→草酰乙酸→丙酮酸→乳酸 在这一反应链中，需要三种酶，即苹果酸脱氢酶(MDH)、草酰乙酰脱羧酶(OADC)和乳酸脱氢酶(LDH)。 • 途径2：苹果酸→丙酮酸→乳酸 在这一途径中，需要在多数生物中发现的苹果酸酶的作用：它可将苹果酸直接脱氢脱羧转化为丙酮酸；丙酮酸则在乳酸脱氢酶的作用下被还原为乳酸 • 途径3：葡萄酒的苹果酸－乳酸发酵途径

20. 苹果酸-乳酸发酵的机理 • 由上述分析可知，葡萄酒的苹果酸－乳酸发酵不可能通过丙酮酸途径，否则将同时形成两种旋体的乳酸。因此，必须考虑这一发酵是由与已知酶类不同的、可将苹果酸直接转化为乳酸的酶所催化的。Kunkee（1975）建议称之为苹果酸－乳酸酶。

21. 五、影响苹果酸-乳酸发酵的因素 酒精 温度 18~20 ℃ SO2 抑制作用 乳酸菌生长 pH ＞3.2 CO2 O2 酿造工艺

22. 六、MLF代谢安全性 • 生物胺（biogenic amine ）：一类含氮的低分子有机化合物的总称。主要是由氨基酸脱羧或醛、酮经胺化或转氨作用形成的含氮化合物。 脂肪族:腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等. 芳香族:酪胺、苯乙胺等. 杂环族:组胺、色胺等。 • 在葡萄酒中可检测到的生物胺包括： 酪胺、组胺、腐胺、色胺、尸胺、2-苯乙胺、甲胺、乙胺、异戊胺、正戊胺、吡咯烷、异丁胺、正丁胺、异丙胺、正丙胺、精胺和亚精胺

23. What are BIOGENIC AMINES Organic compound with an amine group - Heterocyclic Serotonine Histamine - Aromatic Serotonina Tyramine Dopamine - Alifatic Putrescine Cadaverine • In food, produced by the decarboxylation of a precursor amino acid

24. Why are BIOGENIC AMINES important in food industry? High concentrations of biogenic amines are toxic Scombroid food poisoning “Cheese syndrome” Bad breath Putrescine Tyramine Histamine • Allergic responses • Skin flushing • Headache • Abdominal cramps • Nausea • Diarrhea • Headaches • Hypertension Cadaverine

25. In wine, up to 25 different biogenic amines No legal limits in wine, but some recommendations in histamine content applicable to imported wines Switzerland ------ 10 mg/L France ------------- 8 mg/L The Netherlands - 3 mg/L Belgium ----------- 5-6 mg/L Germany --------- 2 mg/L Austria ------------ 10 mg/L USA------------------2 mg/L Is regulation coming?

26. Who is responsible for biogenic amine formation? Lactic acid bacteria histidine Amino Acid - - H + Amino acid decarboxylase CO 2 Biogenic amine histamine Permease

28. 生物胺的作用和毒性 • 组胺：导致周围血管、毛细血管和动脉的扩张，从而引起血压降低、面色发红和头痛。 组胺诱导的肠平滑肌收缩即是由H1受体作用的，这可导致腹肌痉挛、腹泻和呕吐。 • 酪胺：抑制单胺氧化酶活性 • 腐胺、尸胺和胍丁胺：通过抑制组胺氧化增强其对人类的毒害。

29. 生物胺产生机理 • 生物胺产生机理----细菌中的酶对自由氨基酸发生脱羧基作用。 • 非呲哆醛磷酸盐反应机制 在该反应中，丙酮酰的残体代替了呲哆醛—5—磷酸盐，丙酮酰是通过共价键将苯乙胺的残基与氨基酸绑于酶上，并且从丝胺酸残基上分离。 • 呲哆醛磷酸盐反应机制 呲哆醛磷酸盐通过自身催化作用来使氨基酸发生反应。呲哆醛磷酸盐的羧基与氨基酸盐的酶类来作用，并且它可以看作是酶蛋白的活性作用来参与反应的。

30. 酿酒微生物与生物胺 • 多数认为醋酸菌和酵母菌不产胺，乳酸菌是生物胺的主要贡献者 • 在1984和2002年曾有报道尸胺、腐胺、精胺和亚精胺是由发酵中的酵母产生的。Shu-Chen Chang等（2009）研究中发现从台湾产红酒中分离的酵母菌Z. hellenicus var. hellenicus 有低的产组胺能力。

31. 酿酒微生物与生物胺 • 用现代分子生物学方法研究后发现 • 片球菌、酒球菌、乳杆菌和明串珠菌属微生物具有组氨酸脱羧酶（hdc）活性 • 短乳杆菌具有酪氨酸脱羧酶（tdc）活性 • 所有有tdc基因的菌株都可产生酪胺和苯乙胺 • 最近有研究报道，从西班牙的正处于MLF的酒中分离了产腐胺的酒酒球菌菌株，该菌株具有鸟氨酸脱羧酶基因，该基因几乎很少出现在酒酒球菌的基因组中。

32. 葡萄酒中生物胺的控制 • 使用无产胺能力的酵母和乳酸菌。 • 使用具有降酸作用的酵母菌，从而避免使用乳酸菌来降酸。 • 添加足够的SO2。 • 尽早下胶、倒罐、去酒脚澄清或进行瞬间高温灭菌； • 降低贮酒温度至15℃左右； • 添加化学抑制剂。添加细菌素。添加溶菌酶。

33. 氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate） • 也称乌拉坦或尿烷（urethane），分子式C2H5OCONH2，分子量89.09。早在1943年就被证实是一种致癌物质。2007年被国际癌症研究机构（IARC）从2B类提升为2A类。 • 烟草叶及香烟的天然成分 • 发酵食品（如面包，酸牛奶，乳酪、酱油等）和酒精饮料（如葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等）的副产物 • 人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料。

34. 氨基甲酸乙酯的形成 • 焦碳酸二乙酯+氨 • 氨甲酰磷酸+乙醇 • 尿素+乙醇 • 瓜氨酸（citrulline）+乙醇 自发形成

35. 精氨酸脱亚胺基途径（ADI途径） 精氨酸脱亚氨酶 鸟氨酸转氨甲酰酶 氨基甲酸激酶

36. 氨基甲酸乙酯的消除 • 选育酵母菌株 • 利用分子育种技术选育ADI-或ADI酶活低的MLB用于MLF • 添加酸性脲酶，去除葡萄酒中的部分尿素。 • 以去除EC前体物质为目的的酒类除酯新技术将是葡萄酒食品安全研究的新方向。

37. 七、苹果酸-乳酸发酵的控制 • 启动苹果酸-乳酸发酵的方式主要有两种： ①非接种发酵，MLF由葡萄酒中自然存在的苹果酸-乳酸菌群完成； ②接种发酵，MLF由接种经扩大培养的苹果酸-乳酸菌种子液完成。 • 自然诱导 • 提供适宜的环境条件，MLF可以自然发生，这是利用葡萄酒中的天然LAB进行的。自然诱导作为传统方法在法国、瑞士、意大利等国家广泛使用。诱导方法主要包括对葡萄酒进行轻微的化学降酸，尽量降低SO2的用量(＜50mg·L-1)，提供适宜的温度(18～22℃)，适当延长浸渍时间，葡萄酒的酒精含量不超过12%（v/v），适当延长葡萄酒与酒脚的接触时间等。 然而如此条件，往往难以保证MLF的正常触发，相反，有可能导致杂菌感染而引起葡萄酒病害。现在的趋势是人工接种进行MLF。

38. 7.1进行MLF葡萄酒的工艺条件的控制 • 对原料的SO2处理不能高过60mg/L • 用优选的酵母菌进行发酵，防止酒精发酵中产生SO2 • 酒精发酵必须完全（含糖小于2g/L） • 酒精发酵后不能进行SO2处理 • 将葡萄酒的pH调整至3.2 • 接种乳酸菌（大于106cfu/mL） • 在18~20 ℃的条件下添满，密封发酵。

39. 7.2乳酸菌的接种 人工接种进行MLF，生产上常采用的方法有以下几种： 接种经扩大培养的活性干乳酸菌； • 低温保存的试管菌株经扩大培养后接种； • 把正在进行或刚结束的MLF的酒分出一部接入待进行MLF的酒中。（串罐：在需要进行MLF的葡萄酒中加入1/3的正在发酵的葡萄酒）

40. （1）酒精发酵前接种 • 在酒精发酵前接种乳酸菌，有一定的危险性，可能会推迟酒精发酵的触发，降低酵母后期的活性，乳酸菌发酵苹果酸后会发酵糖，从而导致乳酸菌病害。 • 要求：菌株具有单一发酵性，即不发酵基质中的糖，常用植物乳酸菌。 （2）酒精发酵后接种（酒酒球菌） • 此时接种是生产上普遍使用的方法，但乳酸菌必须满足以下条件： • 活化乳酸菌菌体数量必须达到106cfu/mL • 葡萄酒游离SO2不能超过25mg/L • 发酵温度必须控制在18~20 ℃

41. 监控管理：纸层析、HPLC、酶法测D乳酸、观察气体的溢出、变浑浊及感官变化、监测挥发酸、很少数用镜检方法。监控管理：纸层析、HPLC、酶法测D乳酸、观察气体的溢出、变浑浊及感官变化、监测挥发酸、很少数用镜检方法。 • 终点判断：纸层析苹果酸消失，有时不能灵敏地指示MLF是否完成，有时难以区分；苹果酸<200mg/L；乳酸>200mg/L ，认为MLF结束。 • 中止：立即分离转罐并使用50-80mg/L SO2处理。

42. 乳酸菌的抑制与MLF的终止 • 苹果酸-乳酸发酵结束后，乳酸菌群体数量并不迅速下降，如果不及时采取终止措施，则可能导致葡萄酒中其它成分的分解而使酒质败坏。对于一些酸度本来较低和不适合进行苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒，也要抑制乳酸菌的活动。抑制和终止的方法包括： • 分离并添加足够的SO2（50~80mg/L）,添满密封。10~14天后再次分离。 • 降低储酒温度（15℃ 左右） • 添加化学抑制剂。美国允许添加富马酸（0.5g/L）

43. 添加细菌素 Nisin（乳酸链球菌素）Plantaricin（植物乳杆菌素）Pediocin（片球菌素）可以抑制葡萄酒LAB的生长。酒明串珠菌对Nisin非常敏感5µg/ml的Nisin足可以抑制其生长，Plantaricin可以抑制多种乳杆菌，Pediocin可以抑制片球菌； • 添加溶菌酶。 溶菌酶是从蛋清中提取的酶类，该酶对LAB具有很好的溶菌效果，而且随着葡萄酒的pH的增加，酶活增强。使用溶菌酶可以降低SO2的用量而且不影响葡萄酒的感官质量。溶菌酶抑制LAB的用量：白葡萄酒250～500 mg/L，红葡萄酒125～250 mg/L。

44. Thank you for your attention! 谢谢大家