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Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums,

Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides. Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq

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Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums,

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  1. Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128 Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie

  2. Hypermutabilité et adaptation bactériennes

  3. Existence d’une petite proportion de bactéries hypermutables au sein des populations Survie des bactéries dans l’environnement : transmission fidèle du matériel génétique ≠ Adaptation des bactéries à un environnement fluctuant : modification du matériel génétique

  4. Bactéries mutatricesavec mutations favorables Bactéries non mutatrices avec mutations favorables Chemin indirect (rapide) : Mutateur transitoire Chemin direct (lent) Bactéries non mutatrices Bactéries mutatrices Pression de sélection Bactéries mutatricesavec mutations délétères Bactéries non mutatricesavec mutations délétères Hypermutabilité et évolution Taddei et al., Science, 1997

  5. Deux mécanismes principaux de modification du matériel génétique : • Acquisition de matériel génétique étranger (transfert horizontal puis recombinaison homéologue) • Acquisition de mutations et transmission à la descendance (transfert vertical) • Partiellement contrôlés par le système de réparation des mésappariements (SRM)

  6. Marti, T.M. et al., J. Cell. Physiol., 2002 Le SRM chez E. coli

  7. Conservation de la protéine MutS S.aureus 347 ISVKDGGLFKVGFNTQLDEYLEASKNGKTWLAELQAKERQRTGIKSLKISFNKVFGYFIEB.subtilis 350 LSVKEGNLIKDGYNQKLDEYRDASRNGKDWIARLEQQEREYTGIRSLKVGFNKVFGYYIEE.coli 357 VLVRDGGVIASGYNEELDEWRALADGATDYLERLEVRERERTGLDTLKVGFNAVHGYYIQP.aeruginosa 359 AVIRDGGVIKTGYDAELDELQALSENAGQFLMDLEAREKARTGLPNLKVGYNRIHGYFIES.aureus 407 ITRANLQNFEPSEFGYMRKQTLSNAERFITDELKEKEDIILGAEDKAIELEYQLFVQLREB.subtilis 410 VTKANLHLLE--EGRYERNETLTNAERYITPELKEKEALILEAENNICELEYELFTELREE.coli 417 ISRGQSHLAP---INYMRRQTLKNAERYIIPELKEYEDKVLTSKGKALALEKQLYEELFDP.aeruginosa 419 LPRVQAEQAP---ADYIRRQTLKGAERFITPELKAFEDKALSAQSRALAREKALYEELLES.aureus 467 EVKKYTERLQQQAKIISELDCLQSFAEIAQKYNYTRPSFSENKTLELVESRHPVVERVMDB.subtilis 468 KVKQYIPRLQQLAKQMSELDALQCFATISENRHYTKPEFSKD-EVEVIEGRHPVVEKVMDE.coli 474 LLLPHLEALQQSASALAELDVLVNLAERAYTLNYTCPTFIDKPGIRITEGRHPVVEQVLNP.aeruginosa 476 RLIGHLAPLQDSASALAELDVLANLAERALNLDLNRPRFVEHTCLHIEQGRHPVVEQVLES.aureus 527 YNDYVPNNCRLDNETFIYLITGPNMSGKSTYMRQVAIISIMAQMGAYVPCKEAVLPIFDQB.subtilis 527 SQEYVPNNCMMGDNRQMLLITGPNMSGKSTYMRQIALISIMAQIGCFVPAKKAVLPIFDQE.coli 534 EP-FIANPLNLSPQRRMLIITGPNMGGKSTYMRQTALIALMAYIGSYVPAQKVEIGPIDRP.aeruginosa 536 TP-FVANDLALDADTRMLVITGPNMGGKSTYMRQTALIVLLAHIGSFVPAARCELSLVDRS.aureus 587 IFTRIGAADDLVSGKSTFMVEMLEAQKALTYATEDSLIIFDEIGRGTSTYDGLALAQAMIB.subtilis 587 IFTRIGAADDLISGQSTFMVEMLEAKNAIVNATKNSLILFDEIGRGTSTYDGMALAQAIIE.coli 593 IFTRVGAADDLASGRSTFMVEMTETANILHNATEYSLVLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACAP.aeruginosa 595 IFTRIGSSDDLAGGRSTFMVEMSETANILHNATDKSLVLMDEVGRGTSTFDGLSLAWAAA

  8. Conservation de la protéine MutL

  9. SRM et recombinaison • Inhibe la recombinaison entre fragments d’ADN homéologues : barrière à l’échange interspécifique (Matic et al., Trends Microbiol., 1996) • Important pour la notion de mutateur transitoire : réacquisition facilitée d’un SRM fonctionnel par recombinaison (de Visser, Microbiology, 2002) • Confirmé par la structure en mosaïque des gènes mutS et mutL(Denamur et al., Cell, 2000)

  10. Hypermutabilité et pathogénicité • Données contradictoires sur cette relation • Avantage dans certaines pathologies, dans certaines conditions Ex : forte pression antibiotique environnement hostile et fluctuant • Altérations du SRM dans de nombreux cas

  11. Sélection de clonesrésistants Sélection de clones résistants Antibiotique B Antibiotique A Hypermutabilité et résistance aux antibiotiques • Mutateurs = facteurs de risque : • résistance par mutation • mutations compensatoires du coût biologique de la résistance • Antibiotiques = sélecteurs de l’hypermutabilité (Blazquez, Clin. Infect. Dis, 2003)

  12. Hypermutabilité et mucoviscidose

  13. La mucoviscidose • Maladie génétique due à une mutation du gène cftr : atteintes pulmonaires et digestives (circulation difficile du chlore à travers la membrane cellulaire) • Atteinte pulmonaire : mucus épais contribuant à l’inflammation et à l’infection, principale cause de décès

  14. Infections bactériennes chez les malades • Espèces bactériennes impliquées : • H. influenzae (patients jeunes) • S. aureus (patients jeunes) • P. aeruginosa (patients plus âgés) • Adaptation pour combattre la réponse inflammatoire de l’hôte : • P. aeruginosa dits « mucoïdes » • small colony variants de S. aureus • Administration prolongée de multiples antibiotiques

  15. Hypermutabilité des souches isolées de mucoviscidose • P. aeruginosa : 19,5% de souches hypermutables, phénotype surtout dû à des altérations du SRM (Oliver et al., Science, 2000) • H. influenzae : 14,5% de souches hypermutables (Roman et al., J. Clin. Microbiol., 2004)

  16. Les macrolides

  17. Surtout actifs sur les bactéries à Gram positif • Inhibent la synthèse protéique : fixation à la sous unité 50S du ribosome (centre peptidyl transférase)

  18. L4 L22 NISSEN et al., Science, 2000 Résistance par mutation (1)

  19. Résistance par mutation (2) • Particulièrement aux positions A2058 et A2059 • Mutations de l’ARNr 23S (gène rrl) : faible nombre de copies du gène • mycobactéries (1 copie) • H.pylori (2 copies) • S. pneumoniae (4 copies) • Jamais décrites chez S. aureus : 5/6 copies

  20. Macrolide ABC transporteur msr(A) (2) Modification enzymatique (3) Méthylase erm CH3 (1) Ribosome S. aureus Résistance aux macrolides chezS. aureus Gènes de résistance acquis :

  21. Résultats

  22. Point de départ de l’étude • Observation au CHU de Caen : augmentation importante de la proportion de S. aureus résistants aux macrolides isolés de mucoviscidose (<30% en 1997, >50% en 1999) • Corrélation avec l’augmentation de l’utilisation de l’azithromycine pour son effet indirect putatif sur P. aeruginosa (anti-adhésion et réduisant l’inflammation) ?

  23. Analyse des mécanismes de résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose

  24. (4/5) (4/5) (4/5) (4/5) (3/5) (4/6) Mutations de la cible des macrolides

  25. X X X X X X X 1 2 3 4 5 6 2 6 4 X X X X X 3 5 1 Mutation du gène rrl • Mutation successivement dans chaque copie • Mutation d’une copie puis transmission aux autres par conversion génique

  26. Analyse du gène rrl quand 2 mutations adjacentes sont détectées • Les mutations semblent s’être répandues par conversion génique entre les copies du gène rrl : recombinaison facilitée ?

  27. Mutations des gènes domestiques • Détection d’altérations de gènes domestiques chez les souches accumulant de nombreuses mutations ribosomales : • sodA : résistance au stress oxydatif • spa : adhésion

  28. Recherche de souches hypermutables parmi des isolats cliniques de S. aureus

  29. 13 / 89: fréquence de mutation sur rifampicine> 10-7 1 / 74: fréquence de mutation sur rifampicine > 10-7 Test de Mann-Whitney (quantitatif): différence significative (p=0,05) Test de Fisher (qualitatif): différence significative (p=0,0045) Les souches résistantes aux macrolides isolées de mucoviscidose accumulant de nombreuses mutations (ribosome + gènes domestiques) n’étaient pas hypermutables Confirmé sur streptomycine ! Proportion de souches hypermutables chez les S. aureus isolés ou non de mucoviscidose

  30. Analyse moléculaire de mutS et mutL chez les S. aureus cliniques • Gènes très conservés chez S. aureus • 10 paires d’amorces définies • Séquençage intégral de la région mutSL chez les mutateurs et chez 4 souches contenant de nombreuses mutations ribosomales

  31. Mutations de la cible des macrolides

  32. S: souche de référence S. aureus RN4220 A B C S 3A 5B S 3A 5B S 3A 5B Électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN total restreint Hybridation avec une sonde mutS Hybridation avec une sonde rrl (contrôle positif) Etape ultime de l’évolution des S. aureus isolés de mucoviscidose? Souches 3A et 5B • Pas d’amplification avec les amorces mutSL • Le gène mutS est indétectable en Southern blot :

  33. Altérations des protéines MutS et MutL

  34. Analyse des gènes mutS et mutLchez S. aureus

  35. Le SRM des bactéries à Gram positif • Surtout étudié chez B. subtilis, L. monocytogenes, S. pneumoniae • Corégulation des gènes mutS et mutL : • opéron (B. subtilis, L. monocytogenes) • séquences régulatrices similaires en amont (S. pneumoniae)

  36. pBT1 (6.73kb) ? ΔG=-17.3 kJ/mol ? ΔG=-22.4 kJ/mol mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP glpF SA1136 HP 302 pb 14 pb 36 pb 348 pb 12 pb (1993 pb) (8723 pb) (1785 pb) L4L U1L L4S U1S (717 pb) (1211 pb) glpL U5L U5S L1L Analyse in silico de la région mutSL chez S. aureus

  37. (1211 pb) Analyse par RT-PCR de la région mutSL mutS (2619 pb) glpP glpF HP mutL (2010 pb) SA1136 (1993 pb) (+pBT1 = 8723 pb) (1785 pb) (717 pb) T 42 S 42 S 42 S 42 S 2000 pb 1500 pb 1000 pb 500 pb

  38. RN4220 + pORI23mutS pORI23mutS mutS + pORI23mutS RN4220 + pORI23 RN4220 + pORI23mutS1A pORI23mutS1A mutS + pORI23mutS1A pORI23 RN4220 + pORI23mutS29 mutS + pORI23 pORI23mutS29 mutS + pORI23mutS29 Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus

  39. Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus 4 5 6 Log inverse des fréquences de mutation 7 8 9 4220 + pORI23 mutS 4220 + pORI23 mutS1A 4220 + pORI23 mutS29 mutS + pORI23 mutS mutS + pORI23 mutS1A mutS + pORI23 mutS29 4220 + pORI23 mutS + pORI23 4220 mutS

  40. Rôle de MutL dans l’hypermutabilité chez S. aureus 3 4 5 Log inverse des fréquences de mutation 6 7 8 4220 + pAT mutL 4220 + pAT mutL27 4220 + pAT mutL29 mutL+ pAT mutL mutL + pAT mutL27 mutL + pAT mutL29 4220 + pAT392 mutL + pAT392 4220 mutL

  41. mutS pBT1sodA (100%) RN4220 mutL pBT1sodA (97%) pBT1sodA (94%) pBT1sodA (87,5%) pBT1 (TS, CHLR) pBT1sodA (82,3%) pBT1sodA (74%) 3 cultures successives à 42°C + CHL Rôle de MutS et MutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (1)

  42. 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 S. aureus RN4220 y=4.45x10-2X-3.3815 R²=0.9367 Survie après 3 cultures successives à 42°C (ratio de l’inoculum initial) S. aureusmutS S. aureusmutL S. aureusmutS 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 y=4.72x10-2X-3.5188 R²=0.7393 y=4.18x10-2X-3.0942 R²=0.7726 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Survie après 3 cultures successives à 42°C (ratio de l’inoculum initial) Survie après 3 cultures successives à 42°C (ratio de l’inoculum initial) Pourcentage d’identité avec sodA DNA sequence identity Pourcentage d’identité avec sodA DNA sequence identity Pourcentage d’identité avec sodA Rôle de mutS et mutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (2)

  43. Relation entre hypermutabilité et résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose

  44. Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes (p<0,05 Test de Fisher) Résistance à l’érythromycine • 77 % chez les S. aureus hypermutables • 50 % chez les S. aureus non hypermutables

  45. Sélection de clones résistants 4 5 Souches hypermutables 6 Log inverse des fréquences de mutation 7 8 Souches témoins 9 10 Erythromycine Azithromycine Télithromycine

  46. Conclusions (1) • Mucoviscidose : résistance aux macrolides des S. aureus surtout due à des mutations de la cible ribosomale • Au moins trois copies du gène rrl étaient mutées chez chaque mutant de l’ARNr 23S étudié • La dissémination d’une mutation rrl entre les différentes copies du gène semble se faire par conversion génique • Relation avec l’administration prolongée d’azithromycine aux patients atteints de mucoviscidose (?)

  47. Conclusions (2) • Ces observations pourraient être liées à une forte proportion de souches hypermutables chez les S. aureus dans la mucoviscidose: • Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes à l’érythromycine • Les souches hypermutables sensibles aux macrolides acquièrent plus facilement une résistance par rapport aux souches sauvages • L’utilisation de combinaisons d’antibiotiques semble nécessaire pour éviter l’apparition de souches hypermutables

  48. Conclusions (3) • Spécificité de l’hypermutabilité des souches isolées de mucoviscidose ? • Non : forte proportion de mutateurs dans d’autres pathologies (ex: ITU – Denamur et al., J. Bacteriol., 2002) • Effets conjugués des pressions (antibiotiques + réponse immunitaire de l’hôte) : sélection de mutateurs

  49. Conclusions (4) • Rôle de MutS et MutL chez S. aureus : • Hypermutabilité : confirmé chez 4 souches cliniques • Recombinaison : effet limité ? • Perspectives : • Autres gènes mutateurs chez S. aureus ? • Relation entre hypermutabilité et évolution du génome de S. aureus ?

  50. Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128 Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie

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