FLOW SİTOMETRİ (AKAN HÜCRE ÖLÇER)

1. FLOW SİTOMETRİ(AKAN HÜCRE ÖLÇER) Dr.Handan Aksoy

2. Akım Hücre Ölçer (AHÖ) • Çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde bir akış kanalı boyunca tek tek geçmesi ve bu sırada hücre büyüklüğü ve granülaritesine göre sınıflandırılması esasına dayanan bir cihazdır.

3. Tarihçe • 1870-Savart- hızla akan sıvının yüksek frekansla vibrasyonu sonrası ayrımını (SORTİNG) geliştirmiş • 1934-Moldoven-fotoelektrik alıcıyı geliştirmiş akım boyunca kan hücrelerinin sayımı sağlanmıştır • 1949-1956 Coulter kan sayım cihazı geliştirilmiş • 1969-Van Dilla- argon lazer sisteme ilave edilmiş • 1980- Becton Dickinson ile flow sorter (floresan aktive cell sorter) geliştirilmiştir.

4. 1 milyon hücre bir dakikadan daha kısa bir sürede değerlendirilebilir ve çok parametreli bir değerlendirme yapılabilir

5. Kullanım alanları • İmmün fenotipleme • DNA analizi • Hücre prolifersyonu • Hücre ölümü • RNA ve protein içerik analizi • Membran permeabilite ve potansiyellerinin değerlendirilmesi • Drug uptake ölçümü • Mikroorganizma tayini • Hücre içi kalsiyum iyon teknikleri • PH ölçümleri • Glutatyon ölçümleri • Virüs ve viral ürün tayinleri • Transplantasyon….

6. Çalışma prensibi • 3 ana sistemden oluşur • Hidrolik sistem • Akış sistemi; partiküllerin lazer önünden geçişi için taşıyıcı sistem • Optik sistem • Lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan floresan saçılımının çapraz ve silindirik filtereler ile toplanarak düzgün bir şekilde fotodedektörlere aktarılmasında görev alır • Elektronik sistem • Elde edilen optik sinyalin Photo Multiplier Tubes (PMT) ile amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevriminden ve analiz için bilgisayara aktarımından sorumludur.

8. LAZER • Vücut sıvıları doğal süspansiyon halindedir • Ancak taze ve fikse edilmiş solid dokularla çalışmak için süspansiyon haline getirmek gerekir • Süspanse hale getirilmiş hücrelerin analizi için floresan işaretli monoklonal antikorlarla direkt/indirekt olarak işaretlenmesi gerekir • Sistem floresan yoğunluğu ölçümü prensibine bağlı olduğundan işaretli hücrelerden bu floresanı açığa çıkaracak güç kaynağı olarak LAZER kullanılmaktadır • Bu kaynak; Argon, Kripton, Helium-Kadmiyum,Helium-Neon veya daha yüksek yoğunluktaki ışık kaynakları olabilir. • Masa üstü sistemlerde genellikle argon kullanılır ve FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerytrine) gibi floresan boyaları 488nm’de aktive ederek hücre düzeyinde ve/veya içinde floresan yoğunluğu ölçümüne olanak sağlamaktadır.

10. Süspansiyon halindeki hücreler hava basıncı ile sıvı içinden geçirilir, • Sıvının çok hızlı akışı yüksek bir hidrostatik basınç oluşturur • Bu basınçla hücreler cam ve ya kuartzdan yapılmış (flow cell) akış kabinine gelirler • Bu kabinin geometrik şekli ve sıvının laminer akışı hücrelerin tek bir sıra halinde lazer kaynağı önünden geçişini sağlar • Sistemde Forward scatter(FS), Side scatter(SS) ve floresan (FL-1,2,3…) dedektörleri bulunur • FS: hücre yüzey alanı ve büyüklüğü • SS: granülarite ve iç yapısı • Side scatter dedektörü Forward scatter dedektörü Işık kaynağı

17. Floresan boyama teknikleri • İmmünfenotipleme: Hücre yüzeyinde eksprese olan antijen moleküllerine karşı özgül antikorlar kullanılarak hücrelerin tanımlanmasıdır. • Hücre yüzeyindeki bu antijenik yapılar CD(cluster of differentiation) molekülleri olarak adlandırılmaktadır • AHÖ kullanılarak CD molekülleriyle hücrelerin fenotipik özellikleri tespit edilmekte ve istenilen hücreler saflaştırılabilmektedir

18. Örnek hazırlama için en sık kullanılan yöntem tam kan lizis yöntemidir. (Eklem ve plevra sıvılarından hücre süspansiyonu hazırlarken lizis metoduna gerek yoktur.) • Lizis solüsyonu NH4Cl, KHCO3 ve EDTA karışımından oluşmaktadır ve ticari olarak bulunmaktadır. • Antikorlar özgül olarak epitopa, Fc reseptörlerine veya nonspesifik olarak bağlanabilir. • İzotipik kontrol antikoru ve • Otofloresan kontrol analizi yapılmalıdır. (bu iki analizin benzer sonuç vermesi gerekir, öyle değilse problem vardır)

21. İsotip kontrol • Mouse anti humanCD14-FITC –Ig2a • Mouse isotip-FITC-Ig2a : nonspesifik kontrol

24. Temel boyama prosedürü • Primer mAb ve florokrom işaretli ikinci antikorlar • Hücre süspansiyonu+epitop özgül işaretsiz mAb inkübasyon, santrifüj • Florokrom işaretli ikinci antikor ile inkübasyon • Yıkama+%2 formaldehitli PBS • ANALİZ • Primer mAb ve biyotinlenmiş veya hapten konjuge antikorlar • Epitop özgül işaretsiz biyotinlenmiş veya hapten konjuge mAb inkübasyonu, santrifüj • Florokrom işaretli avidin veya anti hapten antikorla inkübasyon • Direkt konjuge antikorlar • Epitop özgül florokrom konjuge mAb • İnkübasyon, yıkama, fiksasyon

33. Çok renkli immünfenotipleme • Boyama yöntemleri aynı anda kullanılır • Çok farklı lenfosit alt gruplarının fenotipik ve fonksiyonel analizleri yapılmaktadır. • Cihazın lazer kompozisyonuna göre aynı anda 20 farklı yüzey antijeni analizi yapılabilmektedir • Rutinde 4 renkli boyama kullanışlı olmaktadır

35. Florokromlar • FITC (fluorescein isothiocyanate) • PE (phycoerytrin) • PETR (phycoerytrin-texas red tandem kompleksi) • PECy5 (phycoerytrin-cyanin 5 tandem kompleksi) • PerCP (perdinin chlorophil-P) • Tümü 488nm’de eksite olurlar, çok renkli boyama yapılırken kompensasyon ayarlarına dikkat edilmelidir

37. Önemli noktalar • Analiz yapılacak hücre konsantrasyonu önemlidir • Boyama ve yıkama sırasında hücreler kaybedilirler • Hücre pelleti 0.3-1ml’de süspanse edilir • Cihazdan saniyede 100-1000 hc geçmesi normaldir • <1000/hc zaman kaybı, >1000/hc kümeleşmeye sebep olur

38. Önemli noktalar • İnkübasyon oda ısısında olmalıdır (22’C) • Prosedür ve kimyasal kitlere bağlı olarak buzdolabı(4’C) veya buzda yapılabilir • Minimum 1 saatlik fiksasyon zamanı önerilmektedir • Aldehitle fikse edilmiş hücrelerin FSC/SSC dağılımları ilk 8 saatte değişmektedir • Fiksasyondan granülosit ve monosittler etkilenir (granüllü hücreler boyamadan sonra hemen okutulmaalıdır) • Fikse edilmiş hücre süspansiyonu 3 gün içinde analiz edilmelidir.

39. Veri analizi • AHÖ, geniş hc toplulukları hakkındaki verilerin hızlıca toplanmasını ve analizini sağlar • Saniyede >70 000 partikül sayar ve her partikül veya hc için 9 farklı renk ve iki yöne saçılan ışık sinyallerini saptar • yazılım: • Cihaz kontrolü, veri kazanımı, analiz ve görüntüleme mümkün • System II yazılımları firmalarca sağlanmakta • WinMDI 2.9, FlowJo ücretsiz internetten indirilebilir yazılımlarla analiz yapılabilir

40. Cihaz kontrolü • Lazer ve dedektör kontrolleri, kalibrasyonu boyalı boncuklar kullanılarak elde edilen histogram grafiklerle yapılır • İki farklı histogramın üst üste getirilmesiyle (overlay) çoklu örneklerden alınan elde edilen parametre verilerinin eşzamanlı gösterilmesi mümkün olmaktadır • Spesifik protein ekspresyon taranması • Anormal gen ekspresyonu gösteren hücre sayılarının belirlenmesi • Eksternel faktörlere yanıt olarak popülasyonun gen ekspresyonu ve proliferasyonunun denetlenmesi

42. Verilerin lineer veya logaritmik ölçekle görüntülenmesi • Floresan ve saçılan ışığın yoğunluğunun lineer veya logaritmik olarak ölçmek mümkündür • DNA’nın boyandığı hc siklusu ölçümünde her zaman lineer amplifikasyon seçilmektedir • İmmünfloresan için seçilen logaritmik amplifikasyon hem zayıf hem de kuvvetli sinyallerin aynı skala üzerinde gösterilmesini sağlar Lineerden logaritmik görüntülemeye geçerek ölçek, pozitif olgular için sıkıştırılırken, negatif olgular için genişletilir. Böylece pozitif ve negatif olgular arasındaki farkı daha iyi değerlendirirken sayılar aynı kalır

44. Kompensasyon(telafi) • Çok renkli deneylerde çok yakın veya çakışan emisyon spektrumundaki boya veya florokromların yarattığı floresan interferensi olasılığı • Çok renkli veri yorumlarını basitleştirmek ve ikili parametre histogramlarında popülasyonları ayırt etmek için çakışan floresanı matematiksel olarak uzaklaştıran özgül yazılım veya donanım manipülasyonu kastedilmektedir • Çoğu zaman araştırıcının deneyimine bağlıdır

46. İstatistiksel analiz • Total sayım • Popülasyon yüzdeleri • Ortalama • Median • Varyasyon katsayısı (CV) • Standart sapma(SS) • Hücrenin floresan yoğunluğunun nicelendirilmesi • Standart kalibrasyon birimi • Eşdeğer solubl florokrom molekülleri • MESF ( molecules of equivalent soluble fluorochrome) • MFI (Mean fluoresence intensity)

48. Zaman parametresinin uygulanması • Zamana karşı floresan yoğunluğunun değişiminin takip eden kalsiyum flux gibi kinetik deneyler uygulanabilir • Zaman ve floresan oranı kombine edilerek detaylı fagositoz, kemotaksi veya oksidatif patlama gibi nötrofil fonksiyonları gözlemlenebilir

50. Hücre içi sitokin ölçümü • İmmün hücrelerden sitokin salınımı ve üretimi hem protein hem de mRNA seviyesinde çalışılabilir • ELİSA, Bioassay, mRNA+ protein ve hc içi sitokin ölçümü gibi farklı metodlar kullanılmaktadır • İşaretli anti sitokin antikorlar kullanılarak yapılmaktadır