APOPTOZİS BİYOKİMYASI

1. APOPTOZİS BİYOKİMYASI

2. Jacobson et al., Cell 88:347 (1997)

3. Nekroz ve apoptozis-Yol açan nedenler Nekroz • İskemi • Hipertermi • Hipoksi • Litik viral enfeksiyon • Toksik maddelerin yüksek konsantrasyonları • Şiddetli oksidatif stress • Apoptozis • Büyüme faktörü eksikliği • Hücre yaşlanması • HIV • Kanser ilaçları • Radyasyon • Yüksek doz glukokortikoid • Fas veya TNFR-1 res. akt. • Sitotoksik T lenfositler • Çok şiddetli olmayan oksidatif stress

4. Nekroz ve apoptozis-Morfolojik özellikler Nekroz • Hücre membranı bütünlüğünün kaybı • Kromatin flokülasyonu • Hücre şişmesi • Organellerin disintegrasyonu • Endoplazmik retikulumun dilatasyonu • Büyük vakuollerin oluşumu • Hücre lizisi • Apoptozis • İntakt hücre membranı fakat membranda “bleb” oluşumu • Kromatinin nükleer membran civarında toplanması ve yoğunlaşması • Hücre küçülmesi • Organellerde disintegrasyon yok • Hücrenin intakt mitokondri, ribozom, nukleus parçaları ve diğer organelleri içeren membranla kaplı apoptotik cisimciklere parçalanması

5. Nekroz ve apoptozis-Biyokimyasal özellikler Nekroz • Bozulmuş iyon hemostazisi • ATP gerekmez (pasif süreç) • +4 oC’de gerçekleşebilir • DNA rastgele parçalanır (agaroz jel elektroforezinde “smear” görüntüsü) • Postlitik DNA fragmentasyonu (=ölümün geç safhasında) • Apoptozis • İyi kontrollu, bazı aktivasyonların ve enzimatik basamakların olması • ATP gereklidir (aktif süreç) • +4 oC’de gerçekleşmez. • DNA internukleozomal alanlarda 180 kb çiftinin katları olacak şekilde kırılır mono ve oligonukleozomlara ayrılır (agaroz jel elektroforezinde merdiven patterni=apoptozisin en önemli belirteci) • Prelitik DNA fragmantasyonu (=erken evrede gerçekleşir)

6. Nekroz ve apoptozis-Diğer özellikler • Apoptozis • Hücreler tek tek veya birkaçı birarada ölür • Fizyolojik şartlarda da gerçekleşebilir • Komşu hücreler veya makrofajlar tarafından fagosite edilirler • İnflamasyon görülmez Nekroz • Hücreler gruplar halinde ölür • Fizyolojik olmayan (patolojik) etkiler sonucu gerçekleşir • Lizozomal enzimler salınır • İnflamasyona neden olur

7. İntiharla Ölüm Hücreler intihar kararı ile şunlara neden olur: • Küçülme olur • Sitokrom c salınımı ile mitokondrileri yıkılır • Yüzeylerinde kabarcık benzeri çıkıntılar gelişir • Nükleusları yıkıldığında kromatin (DNA ve protein) ortaya çıkar

8. Küçük, membran katlantılı, fragmanlara yıkılır • Normalde plazma membranına yerleşik olan fosfolipid fosfatidilserin, yüzeye çıkar. • Bu makrofaj gibi fagositik hücreler ve dendritik hücreler üzerindeki reseptörlere bağlanmakta ve daha sonra hücre fragmanlarını yutmaktadır. • Fagositik hücreler inflamasyonu inhibe eden sitokinleri salgılar.

9. İntiharla ölümdeki sonuçların dizisi öyle düzenlidir ki bu işleme programlanmış hücre ölümü (PHÖ) denilmektedir. • Programlanmış hücre ölümünün hücresel mekanizması mitozisin tersine çevrilmesi gibidir. • Programlanmışhücre ölümü apoptozis olarak adlandırılmaktadır.

10. Apoptozisin tanımı • Zararlı hücrelerin kendilerini öldürdükleri bir yöntem • “hücre intiharı” • Kanser apoptozis aktivitesinin olmamasının sonucudur. Tümörler kendilerini kurban etmekten sakınarak kansere yol açar. Böylece zararlı hücrelerin yapısında apoptozis ortaya çıkmaz.

11. Hücre intiharı nedenleri İki farklı neden vardır: • Programlanmış hücre ölümü mitozisdeki gibi normal gelişme için gereklidir. • Programlanmış hücre ölümü organizmanın bütünlüğüne karşı bir tehdit oluşturan hücreleri yıkmak için gereklidir.

12. Normal gelişmede PHÖ Örnekler: • İribaşın bir kurbağaya metamorfozu sırasında kuyruğunun rezorpsiyonu apoptozis ile oluşur. • Fetusun parmak ve ayak parmaklarının biçimlenmesi aralarındaki dokunun apoptozis ile ayrılmasını gerektirir. • Uterusun iç katının (endometrium) menstruasyonun başlangıcında dökülmesi apoptozis ile oluşur. • Beyinde nöronlar arasında uygun bağlantıların (sinapslar) biçimlenmesi artakalan hücrelerin apoptozis ile eliminasyonunu gerektirir.

13. Tehdit oluşan PHÖ Örnekler: • Virüslerle enfekte hücreler: sitotoksik T-lenfositler aracılığıyla virus ile enfekte hücrelerin ortadan kaldırılması apoptozis ile uyarılır. • İmmun sistem hücreleri: • DNA hasarlı hücreler: p53 güçlü bir apoptozis uyarıcısıdır. • Kanser hücreleri: Radyasyon ve kemoterapi tedavisi apoptozisi uyarır.

14. Hücrenin intihara karar vermesi Yaşam ömrünün sürdürülmesi için gerekli • pozitif sinyallerin azalması, • negatif sinyallerin alınması, arasındaki dengenin bozulması.

15. Pozitif sinyallerin azalması Çok sayıda hücrenin sürdürülen yaşam ömrü, diğer hücrelerden sürekli uyarımlar almasını gerektirir. Bazı pozitif sinyal örnekleri: • Nöronlar için growth (büyüme) faktörleri • Lenfositlerin mitozu için esansiyel faktör olan Interleukin-2 (IL-2).

16. Negatif sinyallerin alınması • Hücre içinde artmış oksidanların düzeyi, • Bu oksidanlar ve diğer ajanların DNA’ya verdikleri hasar, Bunlar: • Ultraviyole ışık • x-ray ışını • Kemoterapötik ilaçlar

17. Moleküller hücre yüzeyindeki spesifik reseptörleri bağlar ve apoptozis programını başlatmak için hücreye sinyal verir. Bu ölüm aktivatörleri: • Tümör nekrozis faktör - alfa ("TNF") TNF reseptörüne bağlanır. • Lenfotoksin (tümör nekrozis faktör – beta olarak ta bilinir) de TNF reseptörüne bağlanır. • Fas ligand (FasL), Fas adlı bir hücre-yüzey reseptörüne bağlanan bir moleküldür. (CD95 olarak ta bilinir)

18. Apoptozis Mekanizması Bir hücrenin apoptozisle intihar kararı vermesi için iki mekanizma vardır. • Biri hücre içinden gelen sinyallerle meydana gelme. • Diğeri hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanan ölüm aktivatörleriyle başlatılma. • TNF • Lenfotoksin • Fas ligand (FasL)

19. Apoptozisin modülatör (mediatör) leri • Bazı iyonlar (kalsiyum), • Moleküller (seramid), • Genler (c-myc), • Proteinler (p53) • Organeller (mitokondri)

20. Apoptozis nasıl çalışır? • Apoptozis kimyasal sinyallere karşı yanıtta yer alır. Hücreler parçalara ayrılır ve bu parçalar paketlenir. Makrofajlar paketleri yutar ve onları yıkar. • Aşağıdaki proteinler apoptoziste yer almaktadır: • ICE-benzeri proteinler • FAS • FAS ligand • BCL-2 • p53

21. ICE-benzer proteinler • ICE = Interleukin-Converting Enzyme (İnterlökin-Dönüştürücü Enzim) apoptozismediatörü • BCL-2 aşırı üretimi ICE-benzer proteazaktivasyonunu inhibe eder. • İntrasellüler asidifikasyon direk ya da indirek yolla ICE-benzer proteazları aktive ederek apoptozisi başlatır. • Tüm apoptotik yollar p53-aracılı transkripsiyon akışı ve ICE-benzer proteazların aktivasyonu ile ilişkilidir.

22. FAS ve FAS ligand • FAS ve FAS ligand tümör nekrozis ailesinin transmembran proteinleridir. • FAS ligand FAS’a bağlandığında hedef hücrenin ölüm olgusunu başlatır. • FAS/FAS ligand sistemiimmün yanıtın sonlandırılmasında da önemli bir rol oynar.

23. Tümör hücreleri FAS ekspresyonunun azaltılmasıyla ile FAS-aracılı apoptozise direnç kazanabilir • Onkogenler ve p53 gibi tümör supresör genlerdeki mutasyonlar FAS sinyal işlemiyle de interfere olur. • FAS-aracılı apoptozis ICE ailesinde yer alan bir sistein proteaz sınıfının aktivasyonunu gerektirir.

24. Bcl-2 ailesi • Bir kısmının apoptozisi indüklediği (Bax, Bad, Bid, Bcl-Xs), • Bir kısmının ise inhibe ettiği (Bcl-2, Bcl-Xl) geniş bir ailedir. • Bu ailenin üyeleri kendi aralarında homo veya hetero-dimerler oluştururlar. • Hücrenin yaşayabilirlik durumu (“survival”ı) bu ailenin pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyelerinin rölatif oranına bağlıdır. • Bu heterodimerlerden biri olan Bcl-2/Bax’ın (ikisinin oranının) bazı hematolojik malignensilerde prognostik değer taşıdığı gösterilmiştir.

25. An Evil Twin: BAX Life/Death Rheostat

26. BAX Activation Death

27. p53 • p53 kromozom 17 üzerinde haritalanmış olan bir tümör supresör genidir, aktivitesi tümör oluşumunu durdurur. • Bir bireyin kansere eğiliminin olması için ebeveynlerinden bir fonksiyonel gen kopyası kalıtımına ihtiyacı vardır. • p53’teki mutasyonlar çoğu tümör tipinde bulunmaktadır.

28. Hücrede, p53 proteini DNA’yı bağlar.  başka bir gen ürünü olan p21 proteinini stimule eder  p21 hücrebölünmesini uyaran protein, cdk2 ile etkileşir  p21, cdk2 ile kompleks oluşturduğunda hücre, hücre bölünmesinin yeni basamağına geçemez. • Mutasyona uğramış p53 DNA’ya etkin bir yolla daha uzun süre bağlanamaz.  böylece, p21protein hücre bölünmesi için stop sinyali olarak etki yapamaz  hücreler daha sonra kontrolsüz olarak bölünür ve tümörler oluşur.

30. Apoptozisin internal sinyallerle başlatılması • Sağlıklı hücrede mitokondri dış zarları yüzeylerinde Bcl-2 proteini eksprese olur. • Bcl-2 Apaf-1proteinin bir molekülüne bağlanır. • Hücredeki internal hasarla Bcl-2, • Apaf-1 serbestleşmesi, • Mitokondriden dışarı sitokrom c’nin daha uzun süre sızmamasına, • neden olur. • Serbestleşen sitokrom c ve Apaf-1 caspase 9 moleküllerine bağlanır.

31. Apoptosom • Sonuçlanan kompleks; • sitokrom c • Apaf-1 • kaspaz 9 • (ve ATP) • Apoptosom olarak adlandırılır. • Bunlar sitozolde agrege olur.

32. Kaspazlar • Kaspazlar (“Caspases”), sistein proteazlardır ve aspartik asitten sonraki peptid bağını kırarlar. • Hücrede inaktif (zimojen) olarak bulunurlar ve proteolitik olarak birbirlerini aktifleştirirler. • Böylece bir kaskad şeklinde işlerler. • Apoptozisde hücreyi parçalayan yani apoptotik morfolojinin oluşumunu sağlayan etkenler olarak bilinirler.

33. Kaspaz • Kaspaz 9 bir düzineden çok kaspaz ailesinin bir üyesidir. Bunlar proteazdırlar. Adlarını proteinleri Asp rezidülerinden kesmeleri nedeniyle alırlar. • Kaspaz 9 diğer kaspaz’ları aktive eder. • Bir kaspaz’ın diğerini aktive etmesi proteolitik aktivitenin geniş bir kaskadını yaratır (kan pıhtılaşması ve kompleman aktivasyonu gibi). Bu durum; • Sitoplazmada yapısal proteinlerin sindirimi, • Kromozomal DNA’nın yıkılımı, ve • Hücrenin fagositozunu başlatır.

34. Apoptozisin eksternal sinyallerle başlatılması • Fas ve TNF reseptörü hücre yüzeyinde gösterilen reseptör domainleri ile integral membran proteinleridir. • Komplementer ölüm aktivatörlerinin (sırasıyla FasL ve TNF) bağlanması sitoplazmaya sinyal geçirir. • Kaspaz 8 aktivasyonunu başlatır. • Kaspaz 8 (kaspaz 9 gibi) bir kaspaz aktivasyon kaskadını başlatır. • Bu da hücrenin fagositozuna yol açar.

35. Örnek: Sitotoksik T hücreleri ne zaman hedeflerini tanır (bağlar)? • Yüzeylerinde çok miktarda FasL üretilir. • Bu hücrenin apoptozis ile ölümüne yol açan hedef hücrenin yüzeyinde yer alan Fas ile bağlanır. • Apoptozisin erken basamakları en azından C. elegans örneğinde gösterilmiştir ki, reversibldir. Bazı olgularda, hücrenin nihai parçalanması bir fagositin hücre içerisine alınması ile garanti edilmektedir.

36. by Displacing “BH3-Only” to Activate BAK BCL-2 Occupied Small Molecule Inhibitor “BH3 Only” Activation BAK BCL-2 “Active” BAK tBID DEATH BCL-2 Inhibitor Restores Death BCL-2

38. Extrinsic pathway

40. LPS TNF CD14 TLR-4 TNFR-1 ? Bax bad bid Mitochondria Caspase 8 ? TRADD Cytochrome c Bcl-2 Bcl-x FADD APAF-1 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-6 Caspase-7 Cleavage of death substrates Potential mechanisms of LPS-mediated apoptosis

41. Apoptoziste hücrelerde görülen morfolojik değişiklikleri • Hücre küçülmesi • Hücre şeklinde değişim • Sitoplazmanın yoğunlaşması • Nükleer zarf değişiklikleri • Nükleer fragmantasyon • Hücre yüzey yapılarının kaybı • Apoptotik cisimcikler • Hücrenin parçalanması • Kalıntıların fagositozu

42. Biyokimyasal değişikilikler • Serbest kalsiyum iyon artışı • bcl2/BAX etkileşimi • Hücrenin su kaybı (dehidrasyonu) • Mitokondriyal membran potansiyeli kaybı • Proteoliz • Phosphatidylserinin dışarı çıkması • Lamin B proteolizi • DNA denaturasyonu • 50-300 kb yarılma • Intranükleozomal yarılma • Protein cross-linking

43. Apoptozisin özet olarak belli başlı aşamaları • Apoptozisin indüksiyonu • Hücre yüzey ölüm reseptörlerinin uyarılması • Sitokrom c’nin salıverilmesi • Apoptozom oluşumu (sitokrom c+Apaf-1 +kaspaz-9) • Mitokondriyal transmembran potansiyelin değişmesi • Kaspazların aktivasyonu • Fosfatidilserinin hücre membranının iç yüzünden dış yüze transloke olması • DNaz’ın aktivasyonu sonucu DNA’nın fragmentasyonu (internukleozomal DNA fragmentasyonu) • Yapısal proteinlerin yıkılmasına bağlı olarak apoptozise özgü morfolojik değişikliklerin meydana gelmesi

44. APOPTOZİSİN SAPTANMASINDA KULLANILAN YÖNTEMLER • Morfolojik görüntüleme yöntemleri • İmmunohistokimyasal yöntemler • Biyokimyasal yöntemler • İmmunolojik yöntemler • Moleküler Biyoloji yöntemleri

45. Morfolojik görüntüleme yöntemleri 1. Işık Mikroskobu a. Hematoksilen Boyama b. Giemsa Boyama 2. Floresan Mikroskobu / Lazerli Konfokal Mikroskop a. Propidium İyodür (PI) b. Hoechst Dye 3. Elektron Mikroskobu* 4. Faz Kontrast Mikroskobu

46. Histokimyasal yöntemler • Anneksin V Yöntemi • TUNEL Yöntemi • M30 Yöntemi* • Kaspaz-3 Yöntemi*

47. Biyokimyasal Yöntemler İmmunolojik Yöntemler: 1. ELISA - DNA Fragmentasyonu - M30 Düzeyi 2. Fluorimetrik YÖNTEM - Kaspaz Aktivasyonu (Hücre kültürü Moleküler Biyoloji Yöntemleri: “DNA Microarrays” Gen ekspresyon dereceleri (mRNA) - Hücre ölüm reseptörleri - Kaspazlar • Agaroz Jel Elektroforezi - DNA fragmentasyonu • “Western Blotting” - Substrat kırılmaları - Aktif kaspaz belirlenmesi - Sitokrom c salıverilmesi • “Flow” Sitometri - DNA azalması - Annexin V

48. 1 kb 0.5kb 2 kb 5 kb DNA merdivenleşmesi ile apoptozisin gösterilmesi 1000 bp ladder 100 bp ladder