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Isolation and characterization of antagonists against Rhizoctonia sp.

Isolation and characterization of antagonists against Rhizoctonia sp. 報告學生：楊麗燕、白瓊文. 前言. * Rhizoctonia sp. （立枯絲核菌）屬於不完全菌綱，以菌核進行感染，是重要的植物病原菌。 * 在純培養下不形成有性與無性胞子，其營養菌絲具有下列特徵： 1. 菌絲的分枝在其起源處有縊縮； 2. 菌絲分枝在距分枝點處不遠有隔膜； 3. 菌絲常成直角或銳角分枝； 4. 菌絲無色至黃褐色，菌落最初為白色至乳白 色，最後呈黃褐色 。.

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Isolation and characterization of antagonists against Rhizoctonia sp.

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Presentation Transcript

  1. Isolation and characterization of antagonists against Rhizoctonia sp. 報告學生：楊麗燕、白瓊文

  2. 前言 *Rhizoctonia sp.（立枯絲核菌）屬於不完全菌綱，以菌核進行感染，是重要的植物病原菌。 * 在純培養下不形成有性與無性胞子，其營養菌絲具有下列特徵： 1. 菌絲的分枝在其起源處有縊縮； 2. 菌絲分枝在距分枝點處不遠有隔膜； 3. 菌絲常成直角或銳角分枝； 4. 菌絲無色至黃褐色，菌落最初為白色至乳白 色，最後呈黃褐色。

  3. * 本菌可為害植株根、莖、葉，造成下位葉黃化，嚴重時，黃化現象向上蔓延，造成立枯病，也可在葉緣或葉鞘上造成不規則黃褐色 條斑等病徵。 * 本菌在水稻上會造成水稻紋枯病，在其他冬 季作物、田間雜草和其他植物上會造成種子 腐爛、根腐病和苗猝倒病，危害範圍相當廣泛，故其防治辦法也有許多研究報告。

  4. * 前人研究 Bacillus spp.、Pseudomonas sepacia、Flavobacterium odoratum、Trichoderma spp.等都具有程度不一的防治效果。

  5. 目的 * 分離並初步鑑定具有能夠對 Rhizoctonia sp.（立枯絲核菌）產生拮抗作用的菌株。

  6. 材料 • 土樣 本組與第五組土樣，故宮路上、青青農場旁及明水路上的菜園。 • 無菌生理食鹽水 • 培養基 （1）1/10 TSA（＋cycloheximide 100 ppm） （2）1/10 TSA （3）MRB（+ streptomycin 30 ppm） （4）PDA （5）WA （6）WA（玻璃紙） （7）NA

  7. 生理及生化測試 ( 1 ) MacConkey agar ( 2 ) Simmons citrate agar slant ( 3 ) Trypticase nitrate broth ( 4 ) Gelatin ( 5 ) Phenol red glucose broth ( 6 ) Phenol red manniol broth ( 7 ) SIM agar ( 8 ) Starch agar

  8. 實驗架構

  9. 實驗方法 採樣 ↓ 篩菌 ↓ 分離 ↓ 純化 自不同農地取得土樣 細菌：1/10 TSA + cycloheximide 100 ppm 真菌：MRB + streptomycin 30 ppm 土樣稀釋後推平板 細菌：由菌落外觀挑選 真菌：只取 Trichoderma 細菌：1/10 TSA 真菌：PDA, WA

  10. ↙ ↘ Trichoderma sp. 細菌 玻璃紙 Rhizoctonia sp. Rhizoctonia sp. ↓ 生化測試 ↓ 鏡檢

  11. 表一、菌株資料與拮抗實驗結果 －：無抑制

  12. 表二、菌株資料與拮抗實驗結果 －：無拮抗效果 N：不生長

  13. 表三、菌株資料與拮抗實驗結果 －：無拮抗效果 * F-3後來證明為真菌

  14. 表四、菌株資料與拮抗實驗結果 －：無拮抗效果 N：不生長

  15. 表五、真菌菌株資料與對峙實驗結果

  16. F-1 G (+) 桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，會隨畫線方向生成紡綞狀，直徑約 0.5-0.8 cm，邊緣粗糙，產孢時菌體會膨大。 • G-4 G (+)桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑0.3-0.5 cm，邊緣不規則，產孢。 • G-5 G (+)桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑0.3 cm左右，邊緣不規則，產孢。

  17. P-5 G (-)球桿菌，菌落為有光澤的乳白色，呈圓形突起，直徑0.1 cm ，具有黏性，不產孢。 • F-3 絲狀真菌，起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄。

  18. TF-2 Trichoderma sp.，產孢後菌落顏色偏黃綠色，分生孢子柄為短瓶狀，孢子是圓形。 • TG-1 Trichoderma sp. ，產孢後顏色偏綠色，分生孢子柄為瓶狀，孢子為略尖的圓形。

  19. 表三、具拮抗能力菌株之生化測試

  20. 結果 1.拮抗實驗所得到的有明顯效果者，在五十三株不同類型的測試菌中共有 10 株，其中Trichoderma spp.有兩株，放線菌有三株，其他種類細菌有四株，還有一株 Penicillium sp.。 2. 經生理生化測試後得知 F-1、G-4、G-5屬於 Bacillus spp.，而剩下一株 P-5 經推論認定屬於 Flavorbacterium sp.。

  21. 3. B. subtilus作為 Gram’s stain 的正對照，經試驗後亦發現有拮抗 R. solani 的能力。 4. 三株 Bacillus spp. 經過進一步的測試後，判斷 F-1、G-4、G-5分別為 B.pantotenticus、B.licheniformis 以及 B.brevis。

  22. 5. Trichoderma spp.八株中僅 TF-2 及 TG-1 有菌絲纏繞現象 6. F-3 菌絲起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄，故認定為 Penicillium sp.。 7. 三株放線菌並未再作進一步鑑定。

  23. 討論 1. 多數的細菌菌株在 PDA平板上不生長，而有拮抗能力的細菌菌株在 PDA 上的表現也多較 NA上差，推斷是因為 pH 值太低，不適合細菌生長。 2. Trichoderma spp.和 Rhizoctonia sp.之間的拮抗無法直接從菌落外表看出，必須經由鏡檢才能確定是否有菌絲纏繞的現象。

  24. 3. F-3是真菌 Penicillium sp.，但卻能在添加cycloheximide 的 1/10 TSA 上生長，也許是它對 cycloheximide 具有抗性。

  25. 有明顯拮抗效果的菌株

  26. 有明顯拮抗效果的菌株

  27. 真菌在分離平板上之形態

  28. Rhizoctonia sp. Trichoderma sp. 顯微鏡下Trichoderma sp. 對 Rhizoctonia sp. 纏繞的情形

  29. 生化測試

  30. 參考文獻 • Hebbar, P., Berge, O., Heulin, T. and Singh, SP. 1991. Bacterial antagonists of sunflower (Helianthus annuus L.) fungal pathogens. Plant soil 133:131-140. • Hoitink, HAJ. 1987 . Production of disease suppressive compost and microorganism culture for use therein. US Patent 4,642,131. • Nielsen, Preben, and Sørensen, Jan. 1997. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology 22:183-192 • Yu G.Y., Sinclar, J.B., Hartman, G.L., and Bertagnolli, B.L. 2002. Production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens suppressing Rhizoctonia solani . Soil Biology and Biochemistry 34:955-963.

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